饮料中腐败酵母菌的分离、鉴定及控制研究

摘 要：目的：研究饮料变败原因及生产中常用防腐剂对其控制效果，为饮料腐败菌的控制及防腐剂的选择、添加提供理论参考数据。方法：以胀瓶的饮料为研究对象，对分离、纯化所得典型菌落进行菌落形态及细胞特征观察，并采用通用引物NL1/NL4扩增菌株26S rRNA序列进行同源性分析，将其作为供试菌，研究生产中常用防腐剂对其控制效果。结果：从样本中分离获得一株乳白色酵母菌KS01，通过其形态特征及26S rDNA序列的同源性分析，确定该菌株为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）；低剂量山梨酸钾和苯甲酸钠均对异常威克汉姆酵母具有显著且持续的抑制效果（P＜0.01）。结论：微生物的生长是导致食品腐败变质的根本原因，不同微生物的致腐能力和特征不同。在新型饮料产品（如具有酸性、富氧、含糖等特征的饮料）的研发工作中需谨防因异常威克汉姆酵母污染导致的产品腐败变质，从而实现食品生产安全高效、低成本。

关键词：腐败酵母菌；分离鉴定；异常威克汉姆酵母；山梨酸钾；苯甲酸钠

Isolation， Identification and Control of Spoilage Yeast in Beverage

ZHOU E1， MA Yu2*

（1.Master Kong Co.，  Ltd.， Beverage IRD Center， Shanghai 201101， China;

2.Microbiology Institute of Shaanxi， Xi’an 710043， China）

Abstract： Objective： Study the causes of beverage deterioration and the control effect of common preservatives used in production， then， provide theoretical reference data for the control of beverage spoilage microorganisms and the selection and addition of preservatives. Method： The spoilage yeast in beverage was isolated， purified and identified from the swelling packages via gradient dilution method. The morphology and cell characteristics of typical colonies were observed. The 26S rRNA sequence was amplified with primer NL1/NL4 and sequenced. The homology analysis was then performed. Then， the antibacterial effects of common preservatives on the strain were then investigated. Result： A milky yeast KS01 was isolated from the spoilage beverage. Morphological characteristics and 26S rDNA sequence analysis proved that KS01 was identified to be Wickerhamomyces anomalus. The follow studies showed that both assium sorbate and sodium benzoate exhibited remarkable and sustainable inhibition effect on W. anomalus （P＜0.01）. Conclusion： The growth of microorganisms is the root cause of food spoilage. Different microorganisms have different abilities and characteristics of causing food spoilage. In the research and development of new beverage products （such as those with acidic， oxygen rich， sugar and other characteristics）， it is necessary to guard against product corruption caused by abnormal Wickham yeast pollution， so as to achieve safe， efficient and low-cost food production.

Keywords： spoilage yeast; isolation and identification; Wickerhamomyces anomalus; potassium sorbate; sodium benzoate

酵母菌（Yeasts）是一类单细胞真核微生物，以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖，也可通过形成子囊孢子进行有性繁殖[1]。酵母菌对环境的耐受性较强，可在低温、低湿、低pH值、高盐度及高糖度等多数细菌无法生长的环境中生存，因此其广泛分布于各生态位，与人类生活息息相关。食品的特性和加工贮藏的条件可抑制细菌的快速生长和竞争力，同时软饮料自身较低的pH值（通常在2.6～4.0）可抑制大多数细菌及病原菌的生长。因此，在高酸性和/或高糖度条件下，酵母菌是食品及工业饮料中普遍存在的腐败微生物源。虽然腐败酵母菌在已知酵母类群中仅占很小的比例，但其会引起食品感官评价降低，进而引起食品腐败等一系列安全问题[2-3]。食品的腐败变质会造成巨大的经济损失，在新型产品研发和生产中防止腐败是食品科学工作者最关注的一个问题[4-6]。

微生物的生长是导致食品腐败变质的根本原因，腐败酵母菌的生长不仅可改变饮料风味，产生浑浊、沉淀物或絮凝物等腐败变质现象，严重时可导致包装膨胀甚至爆炸[7-8]。食品防腐剂作为食品添加剂的一个类别，可通过干扰微生物的遗传物质及功能蛋白的正常运作抑制微生物的生长，从而达到延长食品保鲜期和保质期的目的[9]。食品防腐剂的应用已成为食品产业链的常态，与人们的日常生活密不可分。在食品中添加合适的防腐剂既可以保证食品的风味又能保证食品安全。不同微生物的致腐能力和特征不同，为研究饮料腐败变质的原因，本研究对出现胀瓶的饮料中的腐败酵母菌进行了分离、纯化、鉴定，确定腐败菌的微生物种类，并以其为供试菌，研究了生产中常用防腐剂对其控制效果，以期为饮料腐败菌的控制及防腐剂的选择、添加提供理论参考数据，从而有效解决其在贮藏过程中因微生物变败胀罐问题，实现食品生产安全高效、低成本。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山梨酸钾、苯甲酸钠（食品级），上海阿拉丁试剂有限公司；孟加拉红琼脂培养基，广东环凯微生物科技有限公司；核酸提取试剂及PCR试剂，Takara Bio公司。

1.2 仪器与设备

超净工作台，苏州净化设备有限公司；生化培养箱，天津泰斯特仪器有限公司；数显干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司；电子天平，赛多利斯仪器系统有限公司；移液器，德国Eppendorf；PCR仪，美国ABI；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂；全自动凝胶成像系统，Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株分离与纯化

采用梯度稀释法用无菌生理盐水对胀瓶样品进行10倍递增系列梯度稀释，各稀释度分别取1 mL样品匀液于2个无菌平皿内，加入25 mL 45 ℃孟加拉红琼脂培养基，混合均匀。同时，分别取1 mL无菌稀释液匀液于2个无菌平皿内作为空白对照。待培养基完全凝固后置于28 ℃培养2～5 d。取典型菌落编号为KS01并在分离培养基上进行划线纯化。

1.3.2 菌种鉴定

形态特征及理化实验鉴定参考《酵母菌的特征与鉴定手册》进行鉴定[10]。同时，采用通用引物NL1-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG和NL4-GGTCCGTGTTTCAAGACGG，扩增26S rRNA序列。PCR反应条件为预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃

1 min，退火52 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 80 s，共35个循环；再延伸72 ℃ 5 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至北京华大基因科技有限公司进行序列测定。

1.3.3 不同防腐剂对酵母菌的控制研究

参考《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[11]中规定的添加量，分别配制含0 g·kg-1、0.05 g·kg-1、0.10 g·kg-1和0.15 g·kg-1（4个浓度组）苯甲酸钠及山梨酸钾的样品；同时，用生理盐水将活化后的酵母菌菌株进行梯度稀释，制得菌悬液备用。无菌条件下，在含有不同浓度的苯甲酸钠和山梨酸钾的样品中加入酵母菌菌悬液，使酵母菌的初始浓度为1.5×103 CFU·mL-1。每组样品3个平行，混匀后于28 ℃静置，在第0天、第3天、第7天和第28天分别进行菌落计数统计。以生理盐水为空白对照。

1.3.4 数据统计与分析

应用BLAST程序对所获得的测序结果进行同源性比较，并利用Clustal X及MEGA 6.0软件构建系统发育树；应用Graph Pad 5.0进行进行数据统计及正交实验方差分析。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的分离结果及形态特征

如图1A所示，KS01菌落在PDA培养基上呈乳白色，周围光滑，圆形，中央微隆起，边缘整齐，有明显光泽。菌落直径3～4 mm，黏稠，易于挑取，有芳香味。如图1B所示，其细胞呈卵圆形，大小为（3.0～7.5） μm×（1.5～3.0） μm（长×宽）。

2.2 酵母菌的鉴定结果

菌株KS01经NL1/NL4引物扩增所得26S rDNA序列长度大小为587 bp。利用BLAST软件将该序列在NCBI中已有的序列进行同源性比对，结果发现，菌株KS01与多株异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）的26S rDNA序列的同源性均在100%。利用MEGA 6.0构建系统发育图（图2），明确KS01与相关酵母菌之间的亲缘关系。结合形态鉴定结果和同源性比对及系统发育结果，可认定菌株KS01为异常威克汉姆酵母（W. anomalus）。

2.3 常见防腐剂对酵母菌的控制研究

2.3.1 苯甲酸钠对酵母菌的控制研究

不同浓度的苯甲酸钠对异常威克汉姆酵母菌KS01的控制效果如图3所示。苯甲酸钠对KS01的抑制效果与处理浓度及时间呈正相关，相同处理时间点，样品中酵母菌菌体量随苯甲酸钠浓度的增加而呈逐渐下降趋势；含相同浓度苯甲酸钠的样本中酵母菌菌体量随处理时间的延长呈现逐降低的趋势。因此，不同处理浓度的苯甲酸钠从处理第3天开始均对异常威克汉姆酵母具有显著且持续的抑制效果（P＜0.001）。

2.3.2 山梨酸钾对酵母菌的控制研究

不同浓度的山梨酸钾对异常威克汉姆酵母菌KS01的控制效果如图4所示。山梨酸钾对异常威克汉姆酵母控制效果极显著（P＜0.01），其对异常威克汉姆酵母控制效果与处理浓度及时间呈正相关。处理3 d后，0.05 g·L-1山梨酸钾对KS01的控制效果极显著（P＜0.01），且随山梨酸钾浓度的增加，控制效果逐渐增强（P＜0.001）。同一处理时间，样品中酵母菌菌体量随山梨酸钾浓度的增加而呈下降趋势；同一处理浓度中，随着处理时间的延长，样品中酵母菌菌体含量呈降低的趋势，静置28 d后，菌体含量不足20 CFU·mL-1，说明苯甲酸钠对异常威克汉姆酵母具有显著、持续的抑制效果。本研究中采用的两种防腐剂相比，山梨酸钾更安全，可保持食品原有的产品稳定性，可作为抑制异常威克汉姆酵母污染的首选防腐剂。