双蛋白豆酸乳制作工艺优化及抗氧化作用研究

摘要：目的：优化双蛋白豆酸乳制作工艺，检测抗氧化活性。方法：以大豆和脱脂奶粉为基本原料，基于单因素试验，采用Box-Behnken响应面法优化工艺，通过DPPH自由基清除、超氧阴离子清除、羟自由基清除法检测双蛋白豆酸乳抗氧化活性。结果：优化工艺为干豆 ∶水=1 ∶10.25、脱脂奶粉添加量4.62%、发酵温度40.43 ℃、发酵时间8.68 h，该工艺感官评分89.91，与模型预测值89.85接近，发酵温度影响较为显著；抗氧化活性方面，DPPH自由基清除能力7.919 U/mL、超氧阴离子自由基清除能力10.448 U/mL、羟自由基清除能力3.573 U/mL，与自制酸牛奶相比分别提高13.31%、9.97%、2.61%。结论：单因素试验和响应面法优化后的双蛋白豆酸乳口感佳，与同型乳制品相比有更高的抗氧化活性。

关键词：双蛋白；豆酸乳；工艺优化；抗氧化双蛋白工程是近几年国家大力支持的重大项目，《国民营养计划（2017—2030年）》提出：“以优质动物、植物蛋白为主要营养基料，加大力度创新基础研究与加工技术工艺，开展双蛋白工程重点产品的转化推广”。本研究产品（双蛋白豆酸乳）是以大豆和脱脂奶粉为基本原料，经益生菌发酵而成的乳制品。大豆含有丰富的优质植物蛋白，被冠以“田中之肉”的美誉[1]，且氨基酸种类齐全，含有人体所需的8种氨基酸，是一种健康食品[2-3]。此外，大豆中还含有低聚糖、异黄酮、磷脂、皂苷等功能性物质，是高血压、糖尿病、血管粥样硬化病人及素食主义者的理想食品[4-5]。豆酸乳中的异黄酮对预防肿瘤、心血管等疾病以及缓解更年期症状等有积极的作用[6]，发酵后可生成更多的维生素、矿物质、大量益生菌，对调节肠道菌群及增强机体的免疫功能有非常积极的作用[7-8]。脱脂奶粉是将鲜牛奶脱去脂肪再干燥而成，含有丰富的球蛋白、乳蛋白、酪蛋白，与大豆蛋白形成良好互补作用。本研究对双蛋白豆酸乳制作工艺进行优化，以感官评分为响应值，通过响应面法优化制作工艺。

氧化应激损伤和抗氧化保护作用的理论备受关注[9-11]，筛选具有抗氧化活性的天然资源已成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势。抗氧化肽就是其中一类，它具有抑制生物大分子过氧化和清除体内自由基产物的功能，而且是通过蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食用安全性高[12]。双蛋白豆酸乳具有多种生物活性肽，除了能够提供必需氨基酸外，还具有较强抗氧化作用。本研究通过采用DPPH自由基清除法、超氧阴离子清除法、羟自由基清除法对双蛋白豆酸乳抗氧化活性进行初步探索，以期为双蛋白豆酸乳的高值化利用提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

大豆，黑龙江非转基因大豆；乳糖，美国Leprino Food生产；乳酸菌混合冻干粉，由北京川秀科技有限公司提供；超氧阴离子自由基、羟自由基清除能力测定试剂盒、DPPH、95%乙醇，由青岛科创质量检测有限公司提供；自制酸牛奶（设备、菌种、材料均与双蛋白豆酸乳相同）。

1.2主要仪器设备

胶体磨（JMS～80A），廊坊市惠友机械有限公司；电子天平（BT224S型），赛多利斯科学仪器有限公司；均质机（JJ-01/60），廊坊市冠通机械有限公司；高压蒸汽灭菌锅（LS-B50L），上海华线医用核子仪器有限公司；生物安全柜（BSG-1100IIB2-X），济南鑫贝西生物科技有限公司；酶标仪（MolecularDevices），美国；恒诺低温离心机，湖南；捷美恒温水浴锅，苏州；GC128可见分光光度计，上海。

1.3方法

1.3.1双蛋白豆酸乳制作工艺及优化

（1）双蛋白豆酸乳主要制作工艺：大豆→浸泡→煮豆→磨浆（加脱脂奶粉）→均质→巴氏杀菌→接种→发酵→调制→成品→品评。

（2）单因素试验：以干豆与水的比例、奶粉添加量、发酵温度、发酵时间进行单因素试验，每个水平重复3次，取平均值。在其他因素不变的情况下，评分小组分别对每个因素4个不同水平的双蛋白豆酸乳进行感官评定[13]。①干豆与水的比例对感官评定的影响：以奶粉添加量为5%、发酵温度40 ℃、发酵时间为8 h，测定不同干豆与水的比例（1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12、1 ∶14）对感官评定的影响。②奶粉添加量对感官评定的影响：以干豆与水的比例为1 ∶10、发酵温度为40 ℃、发酵时间为8 h测定不同奶粉添加量（3%、5%、7%、9%、11%）对感官评定的影响。③发酵温度对感官评定的影响：以干豆与水的比例1 ∶10，以奶粉添加量5%、发酵时间8 h测定不同发酵温度（34、36、38、40、42 ℃）对感官评定的影响。④发酵时间对感官评定的影响：以干豆与水的比例1 ∶10、以奶粉添加量为5%、发酵温度为40 ℃，测定不同发酵时间（4、6、8、10、12 h）对感官评定的影响。

（3）响应面法优化制作工艺：综合单因素试验结果，以干豆与水的比例、乳糖添加量、发酵温度、发酵时间为自变量，以感官评定为响应值，根据Box-Benhnken[14]设计原理设计4因素3水平的响应面分析实验（表1）。

（4）感官评分方法：邀请10位专业人员组成评分小组，分别从双蛋白豆酸乳口感（40分）、色泽（20分）、组织状态（20分）、风味（20分）等4个评价项目进行打分，每个评价项目分3个等级（表2），取平均值作为最终感官评定结果。

1.3.2双蛋白豆酸乳抗氧化能力检测

（1）DPPH 自由基清除法[15]：取DPPH 1 mg溶于约20 mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5 min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取1 mL该 DPPH 溶液，在519 nm处测A值，使A处于1.2～1.3之间最佳（表3）。

（2）超氧阴离子清除法[16]：利用 NADH-PMS-NBT 为超氧阴离子生成系统，超氧阴离子清除剂能减少NBT的蓝色。通过检测560 nm处吸光值可判断体系中还原物质的还原能力，计算公式如式（1）：

超氧阴离子自由基清除能力（%）=[空白孔吸光值-（测定孔吸光值-对照孔吸光值）×100]/空白孔吸光值（1）

（3）羟自由基清除能力测定[17]：H₂O₂ / Fe²⁺ 通过Fenton反应产生羟自由基，将邻二氮菲-Fe²⁺水溶液中Fe²⁺氧化为 Fe³⁺，导致536 nm吸光度下降，样品对536 nm吸光度下降速率的抑制程度，反映了样品清除羟自由基的能力（表4）。

1.4数据处理

采用统计学软件SPSS 20.0对所得数据进行处理，组与组之间的比较以x±s表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2结果与分析

2.1双蛋白豆酸乳制作工艺单因素试验分析

2.1.1干豆与水比对感官评分的影响由表5可知，干豆水比1 ∶10时，平均感官得分最高（89.80），P＜0.05说明5个组之间是有差异的。比例越高，双蛋白豆酸乳浓度越稠，口感不佳，且过均质机时容易堵塞；比例越低浓度越稀，营养少，口感差。

2.1.2奶粉添加量对感官评分的影响由表5可知，奶粉添加量为5%时，平均感官得分最高（88.80），P＜0.05说明5个组之间是有差异的。奶粉添加量越高，豆香味越淡，成本高且蛋白比例失调，氨基酸互补性差。

2.1.3发酵温度对感官评定的影响由表5可知，发酵温度为40 ℃时，平均感官得分最高（89.50），P＜0.05说明5个组之间是有差异的。发酵温度低时，益生菌不活跃，发酵产酸不足，影响风味。温度过高，产酸过多，酸味偏重。

2.1.4发酵时间对感官评定的影响由表5可知，发酵时间为8 h时，平均感官得分最高（89.60），P＜0.05说明5个组之间是有差异的。发酵时间短，益生菌数量不足，产酸量低，口感不佳。发酵时间长时，酸涩味加重，口感较差。

2.1.5响应面法优化双蛋白豆酸乳制作工艺如表6所示，随机设计29组试验，以感官评分为响应值，各个试验因子对感官得分的影响按编码因素计算的回归关系式：Y=89.65-0.25A+0.13B+0.14C+0.11D-0.28AC+0.13CD。当大豆与水比为1 ∶10.25、奶粉添加量为4.26%、发酵温度为40.43 ℃、发酵时间为8.68 h时，感官评分最高（89.91），即为最佳工艺条件。

2.2双蛋白豆酸乳抗氧化能力

2.2.1DPPH自由基清除能力测定DPPH法是定量测定食品抗氧化能力的常用方法之一。通过检测519 nm处的特征吸收峰可判定还原性物质减少单电子数量的程度，因而此方法可对双蛋白豆酸乳清除DPPH的能力进行快速的定量测定，从而评价双蛋白豆酸乳的抗氧化能力。如表7所示，双蛋白豆酸乳具有很好的DPPH自由基清除能力，双蛋白豆酸乳的清除率较自制酸牛奶高13.31%。

2.2.2超氧阴离子自由基清除力测定由表7可知，自制酸牛奶和双蛋白豆酸乳均具有清除超氧阴离子的作用，双蛋白豆酸乳的清除率较自制酸牛奶高9.97%。

2.2.3羟自由基清除能力测定由表7可知，自制酸牛奶和双蛋白豆酸乳均具有清除羟自由基的作用，双蛋白豆酸乳的清除率较自制酸牛奶高2.61%。

3讨论与结论

本试验采用大豆和奶粉为主要原料制作双蛋白豆酸乳，在单因素试验的基础上，通过响应面法，以感官评分为响应值优化制作工艺。双蛋白豆酸乳最佳制作工艺是干豆 ∶水=1 ∶10.25、脱脂奶粉添加量4.62%、 发酵温度40.43 ℃、发酵时间8.68 h。大豆和奶粉比例越高，营养成分越高，但在制作过程中会由于浓度过高而堵塞均质机；发酵温度影响益生菌的活性，但温度过高会抑制益生菌的生长；发酵时间对双蛋白豆酸乳口感有显著的影响（P＜0.05），发酵时间少，酸度不够，影响双蛋白豆酸乳的性状；发酵时间过长，酸度过大，影响双蛋白豆酸乳的口感。

双蛋白豆酸乳较自制酸牛奶有更强的抗氧化能力，其中的大豆肽可清除体内代谢产生的自由基，减少组织损伤，提高机体的抗氧化能力。有研究表明，分子量越小，大豆肽抗氧化能力越强[18]；大豆及其制品含有多种天然抗氧化成分，如维生素E、维生素C、异黄酮等[19]，表现出良好的抗氧化活性。大豆及普通大豆食品中的异黄酮主要是以糖苷形式存在，而在发酵过程中，大豆中的糖苷在微生物的作用下转化为活性更高的异黄酮苷元[20]。研究表明，人体利用大豆异黄酮苷元的速度远高于糖苷型，且苷元型大豆异黄酮无论在抗氧化、抗脂质过氧化等方面均比糖苷型高[21]。因此以大豆和奶粉为主要原料经过发酵制成的双蛋白豆酸乳可以提高其抗氧化活性。参考文献

[1]张海生.大豆的营养价值及功效[J］.大豆科技，2012（1）：51-53.

[2]王艳萍，蔚钏，郗宏波，等.发酵型酸豆乳工艺条件的研究[J］.中国乳制品工业，2013，41（3）：61-63.

[3]Wang YP，Wei C，Xi H B，et al.Study on the process conditions of fermented soybean milk[J］.Chinesey，2013，41（3）：61-63.

[4]H P Batt.Characterization of isoflavones inmembrance-proccessed soy protein concentiate[J］.J Food Sci，2003，68（1）：401-404.

[5]李次力.大豆酸乳发酵的菌种筛选[J］.中国粮油学报，2008，23（6）：68-71.

[6]P Scalabrinia，M Rossib，P Spettolia，et al. Characterization of Bifidobacterium strains for use in soymilk fermentation[J］.International Jurnal of Food Microbiology，1998（39）：213-219.