牦牛乳低聚糖与人乳低聚糖的比较研究

摘 要：目的：检测分析牦牛乳特定低聚糖组分、含量及构成比，并与人乳比较，探讨其作为代乳品的优势与不足。方法：对中国西藏若尔盖地区分散采集的20头牦牛产崽1 w时的牦牛乳样本，及从20名分娩足月婴儿的妇女中获得的分娩后2 w（对照1组）和6 w（对照2组）的人乳样本，采用液质联用（LC-MS）方法进行乳汁低聚糖特定组分的定量分析。结果：牦牛乳组14种低聚糖总含量为（269.9±24.1）μg/mL，人乳组14种低聚糖总含量为（4 641.3±1 071.5）μg/mL，其中2 w时含量为 （5 156.1±916.4）μg/mL、6 w时含量为 （4 126.5±979.2）μg/mL，牦牛乳组与2个人乳组两两比较的组间差异显著性均存在统计学意义（P＜0.05）。牦牛乳组与2个人乳组各低聚糖组分含量分别比较显示，乳-N-二岩藻六糖II型（LNDPF II）不存在组间差异（P＞0.05），其余差异显著性均存在统计学意义（P＜0.05）。2个人乳组各低聚糖组分含量比较显示，2′-岩藻糖基化乳糖（2FL）、乳-N-四糖（LNT）、乳-N-二岩藻六糖II型（LNDPF II）、3′-唾液酸乳糖（3′-SL）、6′-唾液酸乳糖（6′-SL）组间差异有统计学意义（P＜0.05），其他无显著性差异（P＞0.05）。牦牛乳组与2个人乳组各低聚糖构成比两两比较显示，均不存在组间差异（P＞0.05）。牦牛乳组中性/酸性低聚糖构成比与2个人乳组分别比较的组间差异显著性均存在统计学意义（P＜0.05）。2个人乳组之间中性/酸性低聚糖构成比不存在组间差异（P＞0.05）。结论：人乳特有低聚糖的组成和丰富程度是其他动物乳不可替代的，牦牛乳低聚糖含量大于牛乳低聚糖含量，其个别中性及酸性低聚糖组分接近甚至超过人乳中同种组分，可能是一种有前途的人乳替代来源。

关键词：牦牛乳;低聚糖;人乳低聚糖;组分

人乳是婴幼儿营养的黄金标准，人乳低聚糖是其主要成分之一，构成人乳中碳水化合物的较大部分（20%，5～20 g/L）[1-2]。人乳低聚糖的多样性丰富，观察到247个品种，162种人乳低聚糖具有结构特征[3]，其组成和丰度因母亲的遗传和哺乳期而异，也受妊娠年龄、母亲健康状况、婴儿性别、饮食习惯、乳母Lewis血型[4]的影响。这些低聚糖起到益生元、免疫调节剂和病原体抑制剂的作用，并被发现能改善肠道和大脑功能。牛奶传统上是婴儿配方奶粉的基础，对牛乳低聚糖的研究少于对人乳低聚糖的研究，与人乳低聚糖相比，牛乳低聚糖的浓度要低得多（0.03～0.06 g/L）[5]。婴儿配方奶粉通常含有益生元，但缺乏人乳低聚糖的特殊功能。牦牛发源于中国，是一种能适应高原地区环境的优势畜种。现阶段，我国丰富的牦牛乳资源尚未被充分开发利用，国内主要的牦牛乳衍生品类型有奶粉、液态奶、酸奶、奶茶和干酪素等，生产和加工企业主要分布在西藏、青海、甘肃、四川等4个牦牛分布多的省份[6]。牦牛乳成分与普通牛乳成分不同，由于畜种及地区等因素限制了对牦牛乳的成分的研究，很少有研究报告牦牛乳低聚糖。本研究检测分析牦牛乳特定低聚糖的组分、含量及构成比，并与人乳比较，探讨其作为代乳品的优势与不足。

1 材料与方法

1.1 奶样和标本收集

1.1.1 牦牛乳 在中国西藏若尔盖地区分散采集的20头牦牛产崽1 w时的牦牛乳样本。样本在环境温度下10 min内收集，干冰运输到实验室，并在-80 ℃下储存。

1.1.2 人乳 从20名分娩足月婴儿的妇女中获得的分娩后2 w（对照1组）和6 w（对照2组）的人乳样本。采集样本后用干冰运送到实验室，并在-80 ℃下储存。

1.2 伦理审核

研究机构伦理审查委员会批准了该研究的所有方面（批件号：SCMCIRB-K2018096-1），并获得了所有母亲的知情同意。

1.3 方法

1.3.1 样本前处理 取乳样100 μL，4 000 g、4 ℃离心10 min后，去除上层脂肪，将50 μL下层清液装新离心管中，然后加入100 μL乙醇。接着12 000 g、4 ℃离心60 min，离心后，乳样分为两部分，低聚糖位于上清液中，底部沉淀为酪蛋白，获取上清液弃去沉淀。向50 μL上清液中加入950 μL纯水。接着取25 μL 稀释后的上清液，加入25 μL NaBH4水溶液（0.5 mol/L），在室温下孵育30 min。接着加入25 μL乙酸溶液（0.5 mol/L）终止反应。最后取10 μL用于LC-MS检测。

1.3.2 基于UPLC-QTOF-MS的低聚糖靶向代谢组学 （1）色谱方法：色谱柱为Hypercarb石墨碳色谱柱（100 mm×2.1 mm i.d.，3 μm;Thermo Fisher）流动相A为水、流动相B为纯乙腈、流速为0.2 mL/min、进样量为10 μL、柱温为25 ℃。（2）质谱条件：离子源类型为ESI，电喷雾离子源。（3）电离模式：负离子模式（ESI-）。（4）数据采集模式：TOFMS采集一级质谱信息，即分子离子峰的精确质荷比，IDAMS/MS模式采集二级质谱信息，即碎片离子的精确质荷比。一级质谱信息主要用于低聚糖化合物的定量分析、二级质谱信息主要用于低聚糖化合物的定性分析。

1.3.3 低聚糖标准品 14种低聚糖标准品包括2′-岩藻糖基化乳糖（2FL）、3′-岩藻糖基化乳糖（3FL）、乳-N-四糖（LNT）、乳-N-新四糖（LNnT）、乳-N-岩藻五糖I型（LNFP I）、乳-N-岩藻五糖II型（LNFP II）、乳-N-岩藻五糖III型（LNFP III）、乳-N-岩藻五糖V型（LNFP V）、乳-N-二岩藻六糖I型（LNDPF I）、乳-N-二岩藻六糖II型（LNDPF II）、唾液酸乳-N-四糖a（LSTa）、唾液酸乳-N-四糖c（LSTc）、3′-唾液酸乳糖（3′-SL）、6′-唾液酸乳糖（6′-SL），均购自法国ElcitylOligoTech公司。其中，中性低聚糖10种（8种岩藻糖基化和2种未糖基化低聚糖）、酸性低聚糖4种（唾液酸化低聚糖）。

1.4 统计分析

所有数据采用SPSS软件进行统计学处理。正态分布的计量资料采用x±s描述，两组之间计量资料比较采用t检验，计数资料采用卡方检验，当P<0.05，认为组间差异的显著性具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 一般资料

本组共牦牛乳20份（20头牦牛产崽1 w时的牦牛乳样本）、人乳40份（从20名分娩足月婴儿的妇女中获得的40份人乳样本，其中，20份为产后2 w采集、20份为产后6 w采集）。

2.2 牦牛乳中14种低聚糖成分测定及其与人乳的比较

2.2.1 低聚糖总量 牦牛乳组14种低聚糖总含量为（269.9±24.1）μg/mL，人乳2组14种低聚糖总含量为（4 641.3±1 071.5）μg/mL［其中对照1组为（5 156.1±916.4）μg/mL、对照2组为（4 126.5±979.2）μg/mL］，牦牛乳组与2个人乳组两两比较的组间差异显著性均存在统计学意义（P＜0.05）。

2.2.2 各低聚糖含量比较 牦牛乳组与2个人乳组14种低聚糖含量分别比较显示，乳-N-二岩藻六糖II型（LNDPF II）不存在组间差异（P＞0.05），其余差异显著性均存在统计学意义（P＜0.05）。2个人乳组14种低聚糖含量比较显示，2-岩藻糖基化乳糖（2FL）、乳-N-四糖（LNT）、乳-N-二岩藻六糖II型（LNDPF II）、3′-唾液酸乳糖（3′-SL）、6′-唾液酸乳糖（6′-SL）组间差异显著性存在统计学意义（P＜0.05），其他不存在组间差异（P＞0.05）（表1）。

2.2.3 各低聚糖构成比及中性/酸性低聚糖构成比比较牦牛乳组与2个人乳组14种低聚糖构成比两两比较显示，均不存在组间差异（表2）。牦牛乳组中性/酸性低聚糖构成比（42.3%/57.7%）与对照1组（80.8%/19.2%）比较的组间差异显著性均存在统计学意义（P＜0.05）。牦牛乳组中性/低聚糖构成比（42.3%/57.7%）与对照2组（82.5%/17.5%）比较的组间差异显著性均存在统计学意义（P＜0.05）。2个人乳组中性/酸性低聚糖构成比不存在组间差异（P＞0.05）。

3 讨论

低聚糖是一类含3～9个单糖单元的碳水化合物，人乳低聚糖含量丰富，是乳汁中第三大固体成分，已知种类高达200余种[7]，具有益生元、免疫调节剂和病原体抑制剂的作用，能改善乳儿肠道功能。牛乳低聚糖结构与人乳相似，已鉴定出67个组分，且含量远低于人乳中的低聚糖，研究报道仅为0.03～0.06 g/L [5]，以6′-SL含量最高，其余低聚糖含量均测不出或微量[8]。牛乳低聚糖构成比与人乳也有所不同，如唾液酸在牛初乳中含量高达70%，而在人初乳中仅为20%[9]。由此可见，牛乳中主要是酸性低聚糖，并随着泌乳期延长由32%（初乳）降低到6%（产乳30 d）[10]，而牦牛乳低聚糖的研究数据未见发表。本研究率先开展对牦牛乳中常见人乳低聚糖的检测分析，已测的14种低聚糖定量结果显示，牦牛乳低聚糖总含量低于人乳，但高于牛乳，约为后者的5～10倍，其中6′-SL含量与牛乳相当。此外，本研究结果说明，牦牛乳与人乳各低聚糖构成比无明显差异，提示牦牛乳低聚糖组成的相对安全性。其中，牦牛乳中性低聚糖占比低于人乳，酸性低聚糖占比高于人乳，与以往文献报道相符[9]。

人乳低聚糖充当益生元，刺激有益菌的生长。纯人乳喂养的婴儿肠道微生物群含高达90%的双歧杆菌，而配方奶喂养的婴儿肠道微生物群与成人相似[11]。低聚半乳糖（GOS）和低聚果糖（FOS）作为益生元经常被添加到婴幼儿配方奶粉中。2FL与肠粘膜上皮细胞的H-2表位的结合，防止空肠弯曲菌粘附到宿主上[12]。2FL通过降低CD14信使核糖核酸（mRNA）的转录来调节CD14的表达，从而抑制I型菌毛大肠杆菌感染引起的炎症[13]。3FL和LNFP II被证明能特异性阻断绿脓杆菌[14]。唾液酸乳糖（SL）能抑制大肠杆菌、铜绿假单胞菌、烟曲霉分生孢子、幽门螺杆菌[15]。6′-SL被认为可以调节婴儿的免疫反应[16]。大鼠NEC模型的研究表明，人乳低聚糖可预防由NEC引起的发病率和死亡率，最强和最一致的保护作用发生在DSLNT[17]。Good等[18]证明，喂食2FL的NEC小鼠幼仔生长更好、疾病更轻，这种作用归因于一氧化氮合酶的上调和肠灌注的恢复。本研究中人乳不同泌乳期2FL、LNFP II、6′-SL含量均大于牦牛乳，说明人乳相较于牦牛乳可能具有更多生物活性功能。

文献报道，产后10 d人乳LNFP II+LNDFP II含量最高，随后逐渐下降[19]；乳酸杆菌优势定植与乳汁LNDFH II含量呈负相关，初乳中乳酸杆菌水平较成熟乳低可能与此有关[20]。本研究结果说明，随着人乳泌乳期延长，至分娩后6 w时LNDPF II含量逐渐下降，而牦牛乳LNDPF II含量与分娩2 w及6 w人乳接近，推测牦牛乳对乳酸杆菌的影响与人乳相似。乳酸杆菌在抑制病原菌，维持微生态平衡等方面起关键作用。

4 结论

近年来，关于人乳低聚糖的研究较多，而对于牦牛乳低聚糖未见研究报道。牦牛乳作为高原地区的优势畜种，尚未被充分开发利用。本研究中共测定14种低聚糖，相较人乳低聚糖已观察到的247个品种，162种低聚糖结构特征[3]，本研究所测低聚糖的丰富程度远远不够，另外低聚糖的功能与其含量及构成比的相关性尚未明确，且低聚糖的影响因素复杂，其组成和丰度因母亲的遗传和哺乳期而异，也受妊娠年龄、母亲健康状况、婴儿性别等因素影响，有待进一步研究阐明。虽然牦牛乳低聚糖组分构成的丰富程度不及人乳，但相较牛乳，牦牛乳仍有其独特的优势，其中个别中性及酸性低聚糖组分接近甚至超过人乳，可能是一种有前途的人乳替代来源。