蕨菜提取液活性物质和抗氧化特性研究

摘要：目的：比较蕨菜提取物的抗氧化特性，探究不同活性成分与蕨菜提取物抗氧化能力的相关性。方法：以蕨菜水提物和醇提物为原料，测定了其总黄酮、总酚和可溶性糖的含量，同时测定了蕨菜提取液的DPPH·、ABTS+·、·OH的清除能力和总还原能力。结果：试验浓度0.2～1.0 g/mL范围内，在同浓度下，蕨菜水提液的抗氧化综合评价值均大于蕨菜醇提液，预示蕨菜水提液抗氧化能力大于蕨菜醇提液。蕨菜提取液抗氧化综合评价值与蕨菜提取液中总黄酮含量的相关系数为0.911（P＜0.01）、与蕨菜提取液中总酚含量的相关系数为0.730（P＜0.05）、与蕨菜提取液中可溶性糖含量的相关系数为-0.456。结论：总黄酮含量、总酚含量和蕨菜提取液的抗氧化能力相关性更强，蕨菜中的黄酮物质与酚类物质在抗氧化方面起到协同作用，其中黄酮类物质对蕨菜提取液的抗氧化性有较多贡献，酚类物质次之。

关键词：蕨菜；活性物质；抗氧化；相关性蕨菜口感优良，因其富含各种营养物质，并含有酚类、黄酮类和生物碱等活性物质，具有较高的食用价值和药用价值[1-3]。Nekrasov等[4]研究表明，蕨类植物中ARA（花生四烯酸）、EPA（二十碳五烯酸）的含量分别为5.5、0.5 mg/g干重，熟蕨保存了长链多不饱和脂肪酸的重要部分，含有4.4 mg/g干重ARA和0.3 mg/g干重EPA。蕨菜精制多糖的药理活性研究表明，在1～50 μg/mL浓度范围内蕨菜精制多糖对小鼠脾细胞增殖有促进作用且对结肠癌细胞有抑制作用[5]。研究表明，蕨菜中含有较为丰富的黄酮类物质、酚类物质和多糖类物质，且以上3类物质均有较强的体外抗氧化活性，其各自的抗氧化能力与其质量浓度呈正相关，因此许多学者研究蕨菜中的黄酮、多酚和多糖的提取工艺，以期获得高质量浓度的蕨菜黄酮、多酚或多糖提取物[6-19]。但是在膳食中人们食用的往往是蕨菜植株，多种营养成分混合体系下每种活性成分表现出的抗氧化能力，与各成分单独地提取物抗氧化能力大小是不同的。研究比较蕨菜醇提液和水提液抗氧化能力的差异、进行蕨菜抗氧化综合评价的文献较少。本试验比较蕨菜醇提液和水提液抗氧化能力的差异，研究蕨菜蕨菜总黄酮、总酚、多糖类物质在混合体系下抗氧化综合评价值之间的相关性。本研究用新鲜蕨菜为原料，直接捣碎与蒸馏水和95%乙醇混合摇匀获得蕨菜粗提液，进行上述试验探究。

1材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜蕨菜，产自湖南省株洲市；芦丁，源叶生物有限公司；没食子酸一水物、ABTS，上海瑞永生物科技有限公司；DPPH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；30%过氧化氢，西陇科学股份有限公司；无水乙醇，恒兴化学试剂制造有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、福林酚试剂、碳酸钠、葡萄糖、蒽酮、浓硫酸、甲醇、过硫酸钾、水杨酸、硫酸亚铁、铁氰化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯乙酸、六水合三氯化铁、L（+）-抗坏血酸，均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

飞利浦搅拌机（HR2095型），飞利浦电子香港有限公司；真空抽滤机（SHZ-D（Ⅲ）型），邦西仪器科技（上海）有限公司；恒温水浴锅（DZKW-S-8型），北京市永光明医疗仪器有限公司；酶标仪（SpectraMax ABS Plus型），MD美谷分子；恒温摇床（HNY-2102C型），欧诺仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1蕨菜提取液的制备选择新鲜且无病虫害的蕨菜，去头去尾洗净并切断捣碎，称取20、40、60、80、100 g捣碎后的蕨菜，分别加入100 mL的蒸馏水和100 mL的95%乙醇中，配成料液比为0.2∶1、0.4∶1、0.6∶1、0.8∶1和1∶1的混合体系，混匀后放置在150 r/min的摇床中24 h，然后抽滤，保留滤液即得不同料液比的蕨菜水提物和醇提物，置于4℃冰箱备用。

1.3.2蕨菜提取液中活性物质的测定（1）总黄酮含量测定：采用硝酸铝比色法测定总黄酮含量[5，14]，绘制芦丁标准曲线。精确移取不同料液比、不同提取方法的蕨菜提取液样品0.5 mL分别置于5 mL离心管中，重复上述试验操作。设置空白对照，每组平行测定3次，结果以芦丁当量表示。（2）总酚含量测定：采用福林酚比色法测定总酚含量[21]，绘制没食子酸标准曲线。精确移取0.5 mL不同料液比、不同提取方法的蕨菜提取液样品，分别置于5 mL离心管中，重复上述操作。设置空白对照，每组平行测定3次，结果以没食子酸当量表示。（3）可溶性糖含量测定：采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量[22]，绘制葡萄糖标准曲线。精确移取0.5 mL不同料液比、不同提取方法的蕨菜提取液样品，分别置于5 mL离心管中，重复上述试验操作。设置空白对照，每组平行测定3次，结果以葡萄糖当量表示。

1.3.3蕨菜提取液体外抗氧化性能的测定（1）DPPH·清除能力测定：参考李榕娣等[17]的方法测定蕨菜提取液DPPH·清除能力，并绘制维生素C标准曲线，测定结果以维生素C当量表示。（2）ABTS·+清除能力测定：参考Xiao Y等[23]的方法测定蕨菜提取液ABTS·+清除能力，并绘制维生素C标准曲线，测定结果以维生素C当量表示。（3）·OH清除能力测定：参考Xiao Y等[23]的方法测定蕨菜提取液·OH清除能力，并绘制维生素C标准曲线，测定结果以维生素C当量表示。（4）总还原能力测定：参考Xiao Y等[23]的方法测定蕨菜提取液总还原能力，并绘制维生素C标准曲线，测定结果以维生素C当量表示。

2结果与分析

2.1蕨菜提取液主要活性物质含量结果与分析

2.1.1总黄酮的含量结果与分析通过试验得出芦丁标样的标准曲线回归方程为A=0.783 7x+0.000 8（R2=0.998 4）。图1结果表明，蕨菜水提液的总黄酮含量在0.05水平上存在显著差异，1.0 g/mL蕨菜水提液的总黄酮含量最高，为（1.745±0.020） mg/g；0.2g/mL蕨菜水提取液的总黄酮含量最低，为（0.463±0.006） mg/g。蕨菜醇提液的总黄酮含量0.6 g/mL与0.8 g/mL的蕨菜醇提液在0.05水平上不存在显著差异，其余浓度存在显著差异。0.8 g/mL的蕨菜醇提液的总黄酮含量最高，为（0.167±0.011）mg/g；0.2 g/mL的蕨菜醇提液的总黄酮含量最低，为（0.006±0.005） mg/g。

陈乃富等[8]从蕨菜黄酮中分离鉴定出2个黄酮单体，分别是芦丁和紫云英苷。所以测定新鲜蕨菜提取液中的总黄酮含量时以芦丁当量表示。由于黄酮苷一般易溶于极性强的溶剂中，且糖链越长在水中溶度越大。在相同质量浓度下蕨菜水提液中的黄酮类物质含量比蕨菜醇提液中的含量高，预示可能是蕨菜所含的黄酮苷糖链较长，所以新鲜蕨菜中的黄酮类物质在蒸馏水中的含量大于相同质量浓度下在95%乙醇中的含量。

2.1.2总酚的含量结果与分析通过试验得出没食子酸标样的标准曲线回归方程为A=40.162x+0.005 8（R2=0.995 2）。测定了蕨菜提取液中的总酚含量，图2结果表明，蕨菜水提液的总酚含量在0.05水平上存在显著差异，0.6 g/mL蕨菜水提液的总酚含量最高，为（6.85±0.17） μg/g；0.8 g/mL蕨菜水提液的总酚含量最低，为（3.75±0.19） μg/g。蕨菜醇提液的总酚含量0.6 g/mL与0.8 g/mL的蕨菜醇提液在0.05水平上不存在显著差异，其余浓度存在显著差异。0.8 g/mL蕨菜醇提液的总酚含量最高，为（2.79±0.09） μg/g；0.2 g/mL蕨菜醇提液的总酚含量最低，为（1.45±0.05）μg/g。新鲜蕨菜中含有一定量的酚类物质，且在相同的质量浓度下，新鲜蕨菜中的酚类物质在蒸馏水中的溶解度大于在95%乙醇中的溶解度。蕨菜水提液中的总酚含量在0.8 g/mL处出现突降，预示可能是随着总黄酮或可溶性糖溶解量的提高，与总酚竞争溶剂，影响了总酚在高浓度体系下的含量。

2.1.3可溶性糖的结果与分析通过试验得出葡萄糖标样的标准曲线回归方程为A=3.228x+0.000 5（R2=0.997 9）。测定了蕨菜提取液中的可溶性糖含量，图3结果表明，蕨菜水提液的可溶性糖含量在0.05水平上0.2、0.4、0.6 g/mL不存在显著差异，1.0 g/mL蕨菜水提液的可溶性糖含量最高，为（3.64±0.17） mg/g；0.4 g/mL蕨菜水提液的可溶性糖含量最低，为（0.63±0.13）mg/g。蕨菜醇提液的可溶性糖含量在0.05水平上0.8 g/mL与1.0 g/mL不存在显著差异，且在0.05水平上0.2、0.4 g/mL不存在显著差异。1.0 g/mL蕨菜醇提液的可溶性糖含量最高，为（8.91±0.87） mg/g；0.2 g/mL蕨菜醇提液的可溶性糖含量最低，为（4.09±1.12）mg/g。新鲜蕨菜中含有较多的糖类物质，且试验表明在相同的质量浓度条件下，蕨菜可溶性糖在95%乙醇中的溶解度大于在蒸馏水中的溶解度。许多研究表明，蕨菜中含有较多的蕨菜多糖，其具有抗氧化活性，它能有效地清除DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子，并且随着多糖浓度的增加而增加[12-14]。

2.2蕨菜提取液体外抗氧化能力的测定结果与分析

2.2.1蕨菜提取液DPPH·清除能力通过试验得出维生素C的标准曲线回归方程为y=1.389 1x+12.198（R2=0.995 6）。测定了蕨菜提取液对DPPH·的清除能力，图4表明，蕨菜水提液对DPPH ·清除能力与浓度呈量效关系；蕨菜醇提液对DPPH ·清除能力在0.2～0.6 g/mL的范围内随着浓度的增大而增强，0.8 g/mL处有显著的减弱。总体上，蕨菜水提液对DPPH·的清除能力大于蕨菜醇提液。

2.2.2蕨菜提取液ABTS+·清除能力通过试验得出维生素C的标准曲线回归方程为y=1.873 6x-2.514 5（R2=0.996）。测定了蕨菜提取液对ABTS+·清除能力，如图5所示，蕨菜水提液对ABTS+·清除能力与浓度呈量效关系；蕨菜醇提液对ABTS+·清除能力在0.2～0.8 g/mL的范围内随着浓度的增大而增强，1.0 g/mL处稍微减弱，但不显著。总体上，蕨菜水提液对ABTS+·的清除能力大于蕨菜醇提液。

2.2.3蕨菜提取液·OH清除能力通过试验得出维生素C的标准曲线回归方程为y=23.907x+0.085 5（R2=0.995 2）。测定了蕨菜提取液对·OH清除能力，如图6所示，蕨菜水提液对·OH清除能力与浓度呈量效关系；蕨菜醇提液对·OH清除能力在与浓度呈量效关系。总体上，蕨菜醇提液对·OH的清除能力大于蕨菜水提液。

2.2.4蕨菜提取液总还原能力通过试验得出，维生素C的标准曲线回归方程为y=0.006x+0.033（R2=0.996 7）。测定了蕨菜提取液总还原能力，如图7所示，蕨菜水提液总还原能力在0.4 g/mL处最大，在0.2 g/mL处最小；蕨菜醇提液总还原能力在0.2～0.8 g/mL的范围内随着浓度的增大而增强，1.0 g/mL处少有减弱，但不明显。总体上，蕨菜水提液总还原能力大于蕨菜醇提液。

2.3蕨菜提取液抗氧化能力的加权综合评价

通过探究蕨菜提取液对不同抗氧化试验的影响，研究不同提取溶剂的蕨菜提取液的抗氧化能力。采用李楠[24]的方法，得出蕨菜提取液总抗氧化能力的加权综合评价表。料液比为0.2∶1的蕨菜水提液用0.2∶1水表示、料液比为0.4∶1的蕨菜水提液用0.4∶1水表示，以此类推。由表1可知，蕨菜提取液的抗氧化综合评价值的变化范围为0.17～1.98，总体上，蕨菜醇提液和蕨菜水提液的抗氧化综合评价值都是随着蕨菜提取液料液比的增大而增大，但蕨菜醇提液的0.8 g/mL和1.0 g/mL各项抗氧化指标在0.05水平上无显著性差异。在相同料液比的条件下，蕨菜水提液的抗氧化综合评价值均大于蕨菜醇提液，且前3名分别为1.0、0.4、0.6 g/mL的蕨菜水提液，其抗氧化综合评价值分别为1.98、1.87、1.80，且分别是相同质量浓度的蕨菜醇提液的2.41、3.46、2.50倍。预示蕨菜水提液的抗氧化能力强于蕨菜醇提液的抗氧化能力。

2.4蕨菜提取液中活性物质含量与抗氧化能力的相关系数