基于Berthelot比色法快速测定糙米中γ-氨基丁酸含量的体系优化

摘 要：目的与方法：Berthelot比色法是目前测定植物组织中γ-氨基丁酸（GABA）含量的最广泛和最常用方法，但测定结果常常受组织特异性、提取方法和显色条件等的影响。为能准确快速地测定糙米中的GABA含量，本研究基于实验室已优化的Berthelot比色法测定植物叶片中GABA含量的技术体系，以蒸馏水为提取剂，从提取料液比、提取温度、提取时间、显色水浴温度和时间对其进行了系统优化。结果：采用Berthelot比色法测定糙米中GABA含量的最佳提取方法为料液比1 g：20 mL、水浴温度60 ℃和水浴时间30 min，最适显色反应条件为显色水浴温度60 ℃和显色时间10 min。结论：优化后的测定体系将尽可能地实现糙米中GABA的充分提取和快速测定，是一个准确可靠、快速经济和科学高效的测定体系。

关键词：糙米；γ-氨基丁酸（GABA）；Berthelot比色法；测定体系优化

γ-氨基丁酸（GABA）是一种天然的四碳非蛋白质氨基酸，广泛分布于动物、植物及微生物中，已成为近些年来的研究热点^[1-10]。2009年，GABA被我国卫生部批准为新资源食品，作为21世纪倡导的绿色食品和有机食品的理想配料，并规定GABA的人体理想保健摄入量是30～100 mg/d^[11-12]。然而，通常生物体内的GABA含量甚微，这就迫使人们去研发富含GABA的农产品或强化食品，作为占世界一半人口主粮的稻米自然而然地成为了首选，在市场上便出现了不同产地和不同品牌的富含GABA的大米。

为了更好地研究生物体、农产品或强化食品中GABA的生理活性、保健功能及作用机制，首要工作就是构建一套简便快速、准确廉价和高通量的GABA测定体系。由于GABA的酸性极强，且自身结构在紫外光区、可见光区和荧光区吸收不灵敏，导致在建立GABA检测方法时存在一定的局限性，大部分方法都需要经过衍生过程才能检测^[13-14]。大量研究证明，采用Berthelot比色法检测样品中的GABA含量具有较高灵敏度、简单易行和快速高通量等优点，但需根据不同样品的性质进行自我优化^[15]。本研究组在2018—2020年间，对基于Berthelot比色法测定植物叶片中GABA含量的体系从测定波长、显色稳定性、显色试剂用量、显色条件、色素杂质去除和提取条件等方面进行了较系统的优化，建立了一套十分简便、快速、准确和廉价的高通量测定植物叶片中GABA含量的技术体系^[16]。但在后续的研究中发现，将已优化的植物叶片中GABA含量的测定体系应用于糙米中GABA含量的测定时，出现了在叶片测定时没有遇到的一些问题，如提取不充分、测定时间过长和显色效果不好等，导致测定结果波动性大和重复性差，这应该是叶片和糙米在有机物组成上的较大差异造成的（如干叶片含纤维素较多，提取较易和较充分；糙米以淀粉为主，提取时易吸水糊化而阻碍内层提取）。为了能准确测定出糙米中的GABA含量，就必须针对现有测定体系中产生的新问题展开深入系统地研究，以期建立适用于快速、准确和高效测定糙米中GABA含量的最佳体系。通过查阅文献和分析问题，本研究基于Berthelot比色法的基本原理和操作流程，围绕提取料液比、提取温度、提取时间、显色水浴温度和显色水浴时间等步骤设置了较系统的优化试验，分析其对糙米中GABA含量测定的影响，从而寻求出最佳的测定条件、建立好完善的测定体系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乐食麦GABA胚芽糙米，上海聚香楼食品有限公司，GABA≥220 mg/kg；GABA标准品，合肥巴斯夫生物科技有限公司，纯度≥99%；四硼酸钠、重蒸酚、次氯酸钠、无水乙醇和蒸馏水等使用试剂均为分析纯，国药集团试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GABA的提取 先用DHG-9101-3SA电热恒温鼓风干燥箱在80 ℃下将GABA胚芽糙米烘干至恒重，后经CY-150型高速多功能粉碎机粉碎得糙米粉末，采用FA1604型电子天平（精度万分之一）称取0.1500 g的糙米粉末于5 mL离心管中，以料液比（g/mL）为1∶20的比例加入蒸馏水（断水自控电热蒸馏水器制备），80 ℃恒温水浴锅振荡提取0.5 h，提取液经TGL-16C微量高速离心机以11 000 r/min的转速离心5 min后，吸取一定体积上清液置5 mL离心管内待用。

1.2.2 GABA的含量测定 采用Berthelot比色法测定糙米中的GABA含量，基本原理是以苯酚和次氯酸钠与GABA的游离氨发生显色反应生成蓝绿色的吲哚酚类物质，先通过测定显色样品的吸光度（O.D.），接着根据同步平行采用GABA标样获得的标准曲线来查找出样品的GABA浓度，最后根据待测液体积和样品质量来计算出样品中的GABA含量。

1.2.3 试验设计 在基于“1.2.1 GABA的提取”和“1.2.2 GABA的含量测定”的基础上，依据操作流程，设置相应的实验处理。以蒸馏水作为提取溶剂，对提取料液比、提取温度、提取时间、显色水浴温度和显色水浴时间5个因素进行不同梯度的试验设计（附表），4次重复。在UV-5100紫外可见分光光度计上进行比色（波长为645 nm），先测定不同试验处理下糙米GABA的O.D.值，后计算出GABA含量，并采用统计学方法分析不同试验处理对糙米GABA含量测定的影响，从而逐步确定出每一个优化项目的最佳参数。

2 结果与分析

2.1 不同料液比的糙米中GABA提取效果差异

从图1可以看出，GABA的提取效果随着料液比的增加先显著骤增后趋于平稳，当提取剂较少时（料液比低于1：17.5），测定的GABA含量显著较低，即GABA的提取不完全，这可能是因为大部分的提取剂被糙米粉中的淀粉吸水糊化膨胀，导致包裹在内层的GABA难以外渗出来；当料液比为1∶17.5～1∶27.5时，GABA的提取效果基本保持不变，无显著差异。因此，为了节约提取剂用量和便于后期的计算，建议选择料液比为1∶20。

2.2 不同水浴提取温度的糙米中GABA提取效果差异

糙米中GABA的提取效果随着水浴提取温度的逐渐升高表现出先显著增大后趋于基本一致，首个平稳点为60 ℃，60～80 ℃间的水浴提取温度对糙米中GABA含量值无显著影响（图2）。为此，推荐选用温度为60 ℃，从而降低电能的消耗、节约用电成本和减少对糙米中高温敏感型有机物的破坏等。

2.3 不同提取时间的糙米中GABA提取效果差异

图3表明，当提取时间为30 min时，糙米中GABA的提取较完全和含量为最高；当提取时间延长至45 min时，GABA的含量则显著降低，这表明GABA会随着提取时间的增加而降解；当提取时间在45～90 min时，不同处理下的糙米中GABA含量无显著差异，这意味着GABA的降解比较迅速，主要发生在提取时间的30～45 min内；综合上述情况，在糙米中GABA的水浴提取时，适宜的提取时长为30 min，过长GABA将发生降解。

2.4 不同显色水浴温度下糙米中GABA含量的差异

显色反应时，水浴的温度与时间是影响反应进程的关键因素。本研究中（图4），当显色水浴时间为20 min时，糙米中GABA含量随着水浴温度的升高表现为先增加后降低的趋势，在水浴温度为60 ℃时达到峰值，显著高于除50 ℃外的其他处理；当温度高于60 ℃时，GABA含量显著降低，这可能是由于温度过高，破坏了GABA的分子间作用力和分子结构，使GABA逐渐分解或析出，导致GABA含量值下降。鉴于本试验结果，在测定糙米中GABA含量时，建议选择60 ℃为显色水浴温度。

2.5 不同显色水浴时间糙米中GABA含量的差异

当水浴温度为60 ℃，显色水浴时间为5 min时的糙米中GABA含量显著低于10 min后的各水浴时间处理，且10 min后的各水浴时间处理间无显著差异（图5）；综合考虑时耗、能耗及成本的情况下，在显色水浴温度为60 ℃时，最佳的水浴显色时间为10 min。

3 讨论与结论

GABA广泛存在于动植物和微生物中，但含量甚微，人们常通过一些强化措施增加农产品或加工食品中的GABA来满足人类健康的需求^[17-20]。Berthelot比色法虽是目前测定植物组织中GABA含量的最广泛和最常用方法，但在具体使用中易受组织中的色素、显色液的稳定性及游离氨等的干扰，更与组织特异性有关^[21-26]。万蓝婷等^[16]为排除不良因素对植物叶片中GABA含量测定结果的影响，围绕测定波长、显色稳定性、显色试剂用量、显色条件、色素杂质去除和提取条件等进行了系统优化，提高了植物叶片中GABA含量测定的精准度和灵敏度，但优化后的测定体系在测定糙米中GABA含量时出现了未预料到的问题。

为了能准确快速地测定糙米中GABA含量，研究人员开展了部分针对性的研究，取得了一些成果。在糙米中GABA的提取方面，段智红等^[27]采用HPLC法测定海稻米中GABA含量的最佳提取料液比为1 g：15 mL；韩延丽等^[28]采用Berthelot比色法测定糙米中GABAG的料液比为1 g：7 mL（室温在每分钟200次的振荡器上振荡4 h）。本研究获得Berthelot比色法测定糙米中GABA的最佳提取料液比为1 g：20 mL。同时，本研究还对提取时的水浴温度和时间进行了优化，筛选出最适水浴温度为60 ℃、水浴时间为30 min，此方法下的GABA提取最充分、含量最高，这比曹磊和陈恩成等^[29-30]将发芽糙米样品分别置于60 ℃和70 ℃水浴锅内振荡提取2 h要缩短75%的提取时间、节省75%的用电量，更加高效和经济，有利于实现大批量样品的快速提取。就显色反应条件而言，陈恩成和李秀娟等^[30，24]认为，沸水浴中加热10～15 min可达理想的反应条件，而本研究表明最佳显色条件为水浴温度60 ℃、显色时间10 min，即显色反应温度较低，显色水浴时间缩短33%，可避免高温下GABA提取损失，同时减少用电量的消耗。

综上可知，本研究确定了以蒸馏水为提取剂，采用Berthelot比色法测定糙米中GABA含量的最佳提取方法为料液比1 g：20 mL、水浴温度60 ℃、水浴时间30 min，最适显色反应条件为显色水浴温度60 ℃、显色时间10 min。与目前普遍使用的测定体系相比，优化后的测定体系将更有利于实现糙米中GABA的充分提取和快速测定，是一个准确高效、快速经济的技术体系，可用于大批量糙米中GABA含量的鉴定、筛选与评价，将为富含GABA糙米的品种改良与培育及GABA强化食品的研制与推广提供准确可靠的科学依据和技术保障。

参考文献

[1]Rashmi D，Zanan R，John S，et al.γ-Aminobutyric Acid（GABA）：biosynthesis，role，commercial production，and applications[J]. Studies in Natural Products Chemistry，2018，57：413-452.

[2]Rojanarata T，Plianwong S，Opanasopit P.Enrichment of gamma-aminobutyric acid in bean sprouts：exploring biosynthesis of plant metabolite using common household reagents[J]. Biochemistry and Molecular Biology Education，2018，46（2）：155-161.