人体肠道中多雷拟杆菌的分离与鉴定

摘 要：目的：从健康人体肠道菌群中分离筛选出拟杆菌菌株，并进行鉴定培养。方法：从4位无肠道疾病史，且在研究前近1个月内未使用抗生素的健康供体中采集粪便样品，于添加有血红素、维生素K1的脑心浸液肉汤培养基中初筛，再于添加有脱纤维羊血、血红素、维生素K1的布氏琼脂培养基复筛，将筛选到的菌株进行形态学及培养特征的观察、革兰氏染色及显微镜的镜检、生理生化鉴定、菌落PCR反应和16S rRNA保守序列测定与分析，以确定种属。结果：筛选得到的NG01菌株经厌氧培养后在血平板上产生灰白色、不透明、表面光滑、边缘规则、湿润、轻微隆起、呈圆形、中等大小的菌落，菌株专性厌氧，呈革兰氏阴性，无芽孢，棒杆状，排列无规则，能发酵葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖等，不发酵D-山梨醇、肌醇、核糖等，氧化酶和过氧化氢酶检测均呈阴性。经Blast序列比对，NG01菌株与Bacteroides dorei 175的16S rRNA相似度达到98.96%。结论：分离得到的NG01菌株在细菌形态、培养特性、生理生化反应结果符合拟杆菌属特征。

关键词：肠道菌群；多雷拟杆菌；分离鉴定；16S rRNA测序

肠道菌群是人体肠道微生物区系的重要组成部分，其中含有将近1 000种菌^[1-2]，能够对食物起到二次消化、吸收的作用。拟杆菌属在粪便中是优势菌种，占粪便微生物的30%～40%，每克粪便中该菌属含量可达到10⁹～10¹¹个，比肠杆菌及肠球菌还要高出4～7个数量级^[3-4]。因此，粪便是筛选拟杆菌株的天然优质来源。拟杆菌属又称类杆菌属，是呈棒杆状、专性厌氧、不产芽孢的革兰氏阴性菌^[5]。拟杆菌属以脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）为模式菌株，是人体肠道菌群的主要成员^[6]，有助于维持正常的肠道生理功能。21世纪益生菌研究领域空前发展，乳酸菌、双歧杆菌、粪链球菌等作为第一代益生菌已应用于微生态学制剂以及人体疾病预防和保健^[7]。拟杆菌凭借其自身独特的性质及理想的人体肠道来源，很有可能成为第二代益生菌的主力菌株，从而起到缓解疾病、恢复人体健康的作用^[8]。因此，开发利用尚未被人发现的拟杆菌，对促进与中国人肠道结构特征兼容的益生菌产品的开发过程具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 磷酸缓冲液溶液（PBS），中国吉诺生物医药技术有限公司；酵母提取物、血红素、维生素K1、脱纤维羊血、细菌生理生化特性鉴定用的葡萄糖发酵管、蔗糖发酵管、3% NaCl甘露糖、乳糖发酵管、山梨醇发酵管、肌醇发酵管、D-核糖、2%过氧化氢酶试剂、氧化酶试纸、厌氧培养袋、厌氧产气包、氧气指示剂，中国海博生物技术有限公司；TIANamp Bacteria DNA Kit 离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR Kit 聚合链式反应试剂盒，中国杭州众鑫仪器有限公司。

1.1.2 培养基 脑心浸液肉汤（BHI）、布氏琼脂培养基（Brucella Agar），中国海博生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 粪便样品的采集和预处理 选择4位1个月内没有药物、抗生素、益生菌使用史的健康成人作为研究对象，其中男性2人、女性2人。研究对象自行采集晨起第一次排出的新鲜粪便中间段没有接触空气和地面的部分，然后将其放入粪便样本采样管内，以此为实验样品。配制磷酸缓冲液PBS：NaCl 8.0 g/L、KCl 0.2 g/L、Na₂HPO₄ 1.44 g/L、KH₂PO₄ 0.24 g/L，用磷酸将pH调至6.8，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。于超净台内称取10 g粪便于无菌容器中，加入80 mL无菌PBS缓冲液，充分搅拌悬浮后用无菌三层纱布过滤，得到粪便原液，取1 mL用血细胞计数板计数，其余立即置于厌氧环境中静置备用。

1.2.2 改良培养基配制 BHI商品培养基粉末38.5 g/L，酵母提取物5 g/L，调pH至7.4，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，冷却至50 ℃以下加入血红素5 mg/L、维生素K1（VK1）1 mg/L，商品VK1浓度为0.02%，每支含量1 mL，因此，每200 mL BHI培养基需加入1支商品VK1。配制布氏琼脂培养基：布氏琼脂商品粉末6.75 g，用NaOH调节pH至7.5，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，脱纤维羊血56 ℃水浴保温30 min，平板冷却至50 ℃以下时加入5%脱纤维羊血、5 mg/L血红素、1 mg/L VK1。

1.2.3 BHI初筛 菌液用无菌生理盐水进行梯度稀释，分别稀释10⁷、10⁸、10⁹倍，然后取96孔板加入180 μL BHI培养基及20 μL经梯度稀释后的菌液，于37℃厌氧培养，每个梯度平行3次。

1.2.4 布氏琼脂血平板复筛 96孔板培养3～4 d后取出观察，记录有明显浑浊的孔位，将这些浑浊的菌液稀释10²、10³、10⁴倍，取100 μL涂布于布氏琼脂血平板上，于37℃厌氧培养。

1.2.5 镜检 目前已知一系列拟杆菌属的传统形态学特征，普遍意义上该属菌落呈灰白色、圆形、凸起，该菌属专性厌氧，呈小杆状，革兰氏染色阴性，本研究根据这一系列传统特征进行初筛。布氏琼脂血平板培养1～2 d后取出，观察菌落特征，记录有明显菌落产生的平板，挑取单菌落于BHI液体培养基内进行37 ℃厌氧培养，另设对照组于有氧、微氧条件下培养。培养1～2 d后观察菌液是否浑浊，取需氧下澄清，而微氧、厌氧下浑浊的菌株，显微镜下镜检、染色观察细菌形态。

1.2.6 生理生化鉴定 （1）葡萄糖发酵实验：取一内盛2 mL无菌水的ep管，用接种针从平板上挑取已纯化单菌落至无菌水中仔细混合成均匀细菌悬液，取3滴滴入葡萄糖发酵管中，接种完后用封口膜封口并放入36 ℃的环境中培养18～24 h。结果观察：阳性为黄色，阴性为蓝色或蓝绿色。（2）蔗糖发酵实验：取蔗糖发酵管，接种方法、培养条件及结果观察均同上。（3）甘露糖发酵实验：取甘露糖发酵管，接种方法、培养条件及结果观察均同上。（4）D-山梨醇发酵实验：取山梨醇发酵管，接种方法、培养条件及结果观察均同上。（5）肌醇发酵实验：取肌醇发酵管，接种方法及结果观察均同上，培养条件为28℃培养18～24 h。（6）乳糖发酵实验：取乳糖发酵管，接种方法、培养条件同上。结果观察：阳性为黄色，阴性为灰紫色、紫色或紫红色。（7）核糖发酵实验：取核糖发酵管，接种方法、结果观察同上，培养条件为24～48 h。（8）过氧化氢酶实验：滴加2～3滴3%过氧化氢酶试剂至菌落或培养基中。结果观察：阳性为产生气泡，阴性为无气泡产生。（9）氧化酶实验：将氧化酶试纸用蒸馏水浸湿，用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落涂在试纸上。结果观察：在30 s内变为蓝色或蓝紫色为强阳性，2 min内不变色为阴性。

1.2.7 菌落PCR扩增与测序 在无菌PCR管中加入20 μL Triton-×100，挑取单菌落于其中充分混合，另设不加菌落为空白对照组。PCR管于100℃恒温水浴2 min，取1 μL上清液为模板，于25 μL PCR反应体系中进行PCR反应，引物采用16S引物（上游引物Eub338F为ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，下游引物Eub518R为ATTACCGCGGCTGCTGG）^[9]。25 μL PCR扩增体系组成为基因组DNA模板1 μL、上游引物（10 μmol/L）1 μL、下游引物（10 μmol/L）1 μL、2xTaq Plus PCR MasterMix 12.5 μL、超纯水 9.5 μL。PCR反应循环程序：①94 ℃预变性3 min；②94 ℃变性30 s；③55 ℃退火30 s；④72 ℃ 延申1 min；⑤将上述3个步骤循环30次；⑥最后在72 ℃延伸5 min。PCR反应结束后，取5 μL反应液在60 V、90 min条件下进行5%琼脂糖凝胶电泳检测，随后送至生工生物公司进行16S rRNA测序，测序结果于NCBI网站进行blast比对。最后利用MEGA 6.0软件采用邻接法、Bootstrap重复次数为1 000次构建系统发育树，根据亲缘关系分析判断筛得菌株的种属。

2 结果与分析

2.1 菌落特征观察

经厌氧培养后观察在血平板上生长出的菌落形态，发现有两株菌落为灰白色、不透明、表面光滑、边缘规则、湿润、轻微隆起、呈圆形、中等大小、直径为1～2 mm，如图1所示，这些条件符合公认的拟杆菌菌落形态，编号这两株菌株为NG01和NG02，其中NG01的菌落直径稍小于NG02，且菌落数量多于后者。

2.2 菌体形态观察及革兰氏染色镜检

NG01和NG02菌液于显微镜下镜检如图2所示，均呈小棒杆状、无芽孢、排列无规则，常单独存在，少见群集。革兰氏染色后，菌体镜检结果呈红色，如图3所示，说明NG01、NG02菌株均为革兰氏阴性，符合拟杆菌为革兰氏阴性的特性。

2.3 厌氧实验

将培养于BHI培养基中的NG01、NG02菌株分别置于有氧、微氧及无氧条件下培养，发现2种菌株在有氧、微氧环境下均无法生长，培养2 d后菌液仍澄清，而在无氧环境下能够生长，菌液浑浊，如图3所示。这与拟杆菌的专性厌氧特性相吻合。

2.4 菌落PCR电泳

NG01、NG02菌株的PCR电泳结果如图4所示，可见样品条带清晰，说明PCR结果较好，产物浓度高，与Marker对照后，发现PCR得到的基因片段大小菌为200 bp左右（图5）。

2.5 生理生化鉴定结果

如附表所示，NG01及NG02菌株能发酵葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖等，不能发酵D-山梨醇、肌醇、核糖等，不产生氧化酶及过氧化氢酶。

2.6 测序及分析结果

16S rRNA测序分析结果显示，NG01及NG02序列相同，说明这2种菌株是属于同一物种，下面只对NG01序列进行分析。经过BioEdit进行序列剪辑合并校准后，得到总序列，其总长度为192 bp，与PCR电泳结果相符合，序列为：ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGAGAGCCTGAACCAGCCAAG-TAGCGTGAAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCT-TTTATAAAGGAATAAAGTCGGGTATGCATACCCGTTTGC-ATGTACTTTATGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAG-CAGCCGCGGTAAT。

Blast结果显示，NG01菌株序列与Bacteroides vulgatus ATCC8482、Bacteroides vulgatus JCM5826及Bacteroides dorei 175序列相似性分别高达99.48%、99.48%、98.96%，人们普遍认为，98%的16S rRNA序列同一性表明菌株是同一物种的成员^[9]，由此可见，NG01（NG02）菌株与Bacteroides vulgatus ATCC8482、Bacteroides vulgatus  JCM5826、Bacteroides dorei 175密切相关。如图6所示，该进化树显示了菌株NG01的系统发育关系，序列相似性水平和进化树的分支模式都说明该菌株应被归入拟杆菌属，分析枝长信息可得，菌株NG01与多雷拟杆菌的物种距离比较接近，说明菌株NG01为多雷拟杆菌。