刺玫果籽油索氏法提取工艺优化及其体外抗氧化活性分析

摘要：目的：对刺玫籽油进行体外抗氧化活性评价，旨在为刺玫籽油的进一步研究及刺玫果的综合开发利用提供科学依据。方法：以刺玫果籽为原料，利用索氏提取法提取刺玫果籽油，并以刺玫果籽油的提取率为指标，在单因素分析的基础上，选取提取温度、粉碎目数、溶剂体积3个因素进行响应面优化试验。以维生素C为阳性对照，对所提取的刺玫果籽油进行体外抗氧化活性分析。结果：当溶剂体积333  mL、提取温度82 ℃、粉碎度60目时，刺玫果籽油的提取率为18.84%。此外，刺玫果籽油清除ABTS 自由基、DPPH自由基、超氧阴离子自由基的作用存在量效关系，且IC50值分别为29.73、34.58、40.54 μg/mL，而同浓度维生素C清除自由基的IC50值分别为26.51、49.62、26.37 μg/mL，此外，刺玫果籽油还具有一定的还原力。结论：利用响应面优化法优化提取工艺参数可提高刺玫籽油的提取率，刺玫籽油还具有较好的抗氧化活性，可作为一种潜在可用的天然抗氧化剂。

关键词：刺玫果;种子油;索氏提取法;中心组合响应面设计 ;抗氧化活性

刺玫果（Rosa davurica）是一种药食同源的野生浆果，主要分布于中国吉林、辽林、黑龙江省等地。刺玫籽蕴藏的油脂中包含各种维生素、类胡萝卜素[1] （β-胡萝卜素、番茄红素）、植物甾醇[1]、角鲨烯、多酚及多不饱和脂肪酸（52.52%亚油酸、23.50%亚麻酸、12.39%油酸、5.88%棕榈酸）[2]等营养物质[3-7]。同时，刺玫籽油也是一种极好的天然保湿油 [8-9]。此外，屈岩峰等[10]报道了往一级大豆油中添加0.2%的刺玫果籽油具有较好的抗氧化效果;高阳等[11]报道了不同溶剂的刺玫果种子萃取物具有一定的抗氧化活性。目前，提取刺玫籽油的方法主要有酶解法、超临界CO2萃取法、超声提取法，而利用响应面法优化索氏提取刺玫籽油及其体外抗氧化活性分析尚无相关文献报道。本试验以刺玫果籽为原材料，利用索氏提取法提取刺玫籽油，并采用Central Composite Design响应面优化法（CCD-RSM） 对工艺参数进行优化，再以维生素C为阳性对照，利用ABTS（ABTS+·）法，DPPH（DPPH·）法，超氧阴离子自由基（O-2·）清除法及还原Fe3+作用对刺玫籽油进行体外抗氧化活性评价，旨在为刺玫籽油的进一步研究及刺玫果的综合开发利用提供科学依据。

1材料与方法

1.1原料

刺玫果;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海金穗生物科技有限公司;2，2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐（ABTS），合肥巴斯夫生物科技有限公司。

1.2主要仪器设备

TGL-16LG高速离心机，湖南星科科学仪器有限公司;0SB-2100旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司;Synergy MX酶标仪，美国BIOTEK公司。

1.3方法

1.3.1刺玫籽油的提取溶剂的选择准确称取刺玫籽粉末20.00 g，装入脱脂滤纸筒中，并以无水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚为提取溶剂，利用索氏提取法在适宜的条件下进行刺玫籽油的提取，刺玫籽油提取率按式（1）计算。

y=m2m1×100% （1）

式（1）中，m1为刺玫籽粉末质量（g）;m2为刺玫果籽油质量（g）。

1.3.2单因素试验准确称取20.00 g刺玫籽粉末于脱脂滤纸筒中，利用索氏提取法提取刺玫果籽油，并以溶剂体积、提取温度、粉碎目数、提取时间5个因素进行单因素设计。设定溶剂体积分别为140 、200、260、320、360 mL;提取温度分别为70、75、80、85、90 ℃;粉碎目数分别为0、20、40、60、80目;提取时间分别为180、210、240、270、300、330 min，分析各个因素对刺玫籽油提取率的影响。

1.3.3CCD-RSM法优化刺玫籽油提取工艺参数在单因素试验的基础上，选溶剂体积（X1）、提取温度（X2）、粉碎目数（X3）作为变量，刺玫籽油提取率为响应值进行响应面优化实验。利用Design Expert10.0.3软件，进行Central Composite Design（CCD）实验方案，进行三因素三水平试验设计，并将所得结果进行相应的统计学分析，确定最优的工艺参数，试验因素及水平见表1。

1.3.4刺玫籽油体外抗氧化活性研究

（1）刺玫籽油清除ABTS+·活性测定：将ABTS溶液与过硫酸钾溶液等体积混合，置于黑暗条件下氧化12 h，然后加无水乙醇稀释反应液，并在734 nm波长下调节其吸光度值为0.7左右。其次，利用无水乙醇将刺玫果籽油配制成一序列质量浓度，并以维生素C溶液作为阳性对照，在96孔板中加入100 μL的ABTS工作液及30 μL的样品溶液，震荡混匀，避光反应5 min，于734 nm波长处测定溶液的吸光度值A，以式（2）计算刺玫籽油清除ABTS活性[12]。

ABTS+·清除率%=（A0-A样）A0×100%（2）

式（2）中，A样为30 μL样品溶液与100 μL ABTS溶液混合后的吸光度值;A0为30 μL乙醇溶液与100 μL ABTS溶液混合后的吸光度值。

（2）刺玫籽油清除DPPH·活性测定：将配置好的DPPH乙醇储备液，加无水乙醇溶液稀释，并在517 nm波长处调节吸光度值为0.7左右。与ABTS试验相似，在96孔板中加入100 μL的DPPH溶液及30 μL的样品溶液，震荡混匀，避光反应30 min后，于517 nm波长处测定溶液的吸光度值A，以式（3）计算刺玫籽油清除DPPH·活性[11]。

DPPH·清除率（%）=（A0-A样）A0×100%（3）

（3）刺玫籽油清除O-2·活性测定：参照文献[13]，并稍作修改，精密量取500 μL Tris-HCl（pH 8.2）溶液于12支试管中，置于37 ℃水浴锅内预热20 min。待预热结束后，于试管中分别加入不同浓度样品溶液，在其中的6支试管内加入40 μL邻苯三酚溶液（25 mmol/L），充分混匀后置于37 ℃水浴锅内反应5 min，加入8 mmol/L HCl终止反应。最终，移取 100 μL溶液置于325 nm波长处测光度值A，并利用式（3）计算刺玫籽油对O-2·的清除率。

O-2·清除率（%）=[A0-（A1-A2）]A0×100%（4）

式（4）中，A0为含有邻苯三酚的空白溶液的吸光度值;A1为含有样品溶液及邻苯三酚的吸光度值;A2为只含样品溶液的吸光度值。

（4）刺玫籽油还原力的测定：参照文献[14-15]。

1.3.5数据处理每组做3个平行样，结果以X±SD值表示，利用SPSS 23.0统计软件进行单因素方差分析及差异性分析，P<0.05表示差异性具有统计学意义，并利用GraphPad Prism 8.0.1 进行图的绘制。

2结果与讨论

2.1不同溶剂对刺玫籽油提取率的影响

选取石油醚、正己烷、乙酸乙酯、无水乙醇4种溶剂分别提取刺玫籽油。由图1可知，4种常用的提取溶剂对刺玫籽油的溶解性具有差异性，其中以石油醚为提取溶剂所获得的刺玫籽油量最佳，为11.23%;正己烷为10.96%;无水乙醇为5.74%;乙酸乙酯最低，为2.09%。其中，石油醚沸程长，回收时温度不易控制，而正己烷的沸程短、毒性低、且提取率与石油醚相差0.27%，故选取正己烷为刺玫籽油的提取溶剂。

2.1.1提取时间对刺玫籽油提取率的影响在水浴温度为80 ℃、粉碎度为60目、溶剂260 mL的条件下，分析180、210、240、270、300、330 min时对提取率的影响。由图2可知，当提取时间为180 min时提取率最低为8.96%，且伴随温度升高，刺玫籽油的提取率逐渐升高，240 min时刺玫籽油的提取率达到最高为12.88%;但超过240 min时刺玫籽油提取率略下降，且所得的油内有白色乳浊液。可能是由于加热时间过长导致溶剂的挥发及刺玫籽油中某些成分分解。此外，唐小媛等[16]研究表明，长时间的萃取会加剧油脂乳化，严重影响油的质量。因此综合考虑选取240 min为最终提取时间。

2.1.2粉碎度对刺玫籽油提取率的影响水浴温度为80 ℃、溶剂体积260 mL、提取时间为240 min时，分析不同粉碎度对刺玫籽油提取率的影响。由图3可知，不粉碎刺玫籽时，刺玫籽油提取率为4.52%，随着粉碎目数的增大，呈上升状态。这是由于随着比表面积的增大，刺玫籽与溶剂接触面积增大，促进了油的溶出;此外，由于破坏细胞结构也可使正己烷与细胞内的油脂充分接触[17]。当粉碎度达60目时，刺玫籽油提取率最高为13.56%，而80目时提取率为13.51%，油中存在大量杂质。这可能是长时间的研磨，导致油脂达到损失，而且刺玫籽粉末的粒径过小时，会导致粉末堆积密度增大，从而降低了溶剂的扩散速率，致使刺玫籽油提取率减少[18]。故选取60目为后续实验的粉碎度。

2.1.3溶剂体积对刺玫籽油提取率的影响当提取温度为82 ℃、粉碎度为60目、提取时间为240 min的条件时，分析溶剂体积分别为140、200、260、320、380 mL对油脂提取率的影响。由图4可知，当溶剂体积为140 mL时，刺玫籽油提取率最低为9.77%，200 mL时达到最高为13.03%，这是由于浓度差的存在，伴随溶剂量的增大，提取率亦增加。溶剂体积为260 mL时提取率为11.34%，这可能是由于溶剂中油脂浓度达到饱和状态，促使刺玫籽中油脂溶出的动力减少，从而导致刺玫果籽油的提取率降低。蒋新龙等[19]人的实验结果表明，棠梨籽中油脂降低时，导致有效浓度差减小，即使增加溶剂量，对棠梨籽油的提取率的影响也较小，还会造成溶剂的浪费。因此，选取溶剂体积为320 mL用于后续的实验。

2.1.4温度对刺玫籽油提取率的影响当粉碎度为60目、提取时间为240 min、溶剂体积为320 mL时，分析温度为70、75、80、85、90℃时对提取率的影响。由图5可知，当水浴温度为70 ℃时籽油提取率最低为2.00%，80 ℃时为13.11%，可能是由于随着温度的升高，加剧了刺玫籽油内分子热运动，促进了刺玫籽油的溶出及正己烷的渗透;当水浴温度为85 ℃时，刺玫籽油的提取率达到最高为13.77%;而温度为90 ℃时，籽油提取率为12.50%，油颜色较深，伴随大量杂质，可能是由于温度过高导致短期内正己烷的大量蒸发，而冷凝效果不变，使得溶剂未能与原料充分接触，降低了油脂的扩散速率。Mohammadpour等[20]研究表明，当温度过高可导致正己烷气化，致使液固比降低及低沸点物质的分解。因此，鉴于刺玫籽油的品质及提取率，选取温度为85 ℃为刺玫籽油提取的最适工艺参数。

2.2响应面优化结果分析

2.2.1建立回归模型方程由单因素方差分析得出提取时间P>0.05，故提取时间对刺玫籽油提取率的影响较小。因此，选取料液比、温度、粉碎目数为响应面设计因素，进行中心组合设计。利用Design8.0对表2中的数据进行回归分析可得响应面模型方程：Y=18.08-0.062X1-0.32X2+4.81X3-0.3X1X2+0.23X1X3-0.68X2X3-0.77X12-0.34X22-6.19X32

2.2.2模型及回归方程系数的显著性检验由表3可知，F回归=475.09，P<0.000 1，表明该模型达到显著性水平，其回归方程具有统计学意义，模型可靠，可用来分析与预测刺玫果籽油的提取率;失拟P=0.1019>0.05，不显著，说明该模型拟合较好，其建立的回归方程比较准确;此外，决定系数R2与调整系数Radj2的差别不大，说明本模型拟合度较佳，可用于确定本试验的最佳工艺[20]。其次，溶剂体积（X1）、水浴温度（X2）、粉碎目数（X3）对刺玫籽油的提取率均有显著性的影响; 由P值可知，各因素对刺玫籽油的提取率的影响大小为X3>X2>X1，即粉碎度>温度>溶剂体积;X2与X3的交互作用影响极显著，而X1与X2，X1与X3的交互作用影响显著;模型中X2、X3、X2X3、X12、X32对Y值的都具有显著性的影响，说明试验因素对响应值不仅是单纯的线性关系，而且都具有显著性影响。此外，由图6可知，X2、X3的曲线相对于X1的较为陡峭，表明水浴温度、粉碎目数对刺玫籽油提取率的影响程度大于溶剂体积;等高线图是