响应面法优化刺梨多酚的超声提取工艺及其抗氧化性研究

摘 要：目的：得到超声辅助提取刺梨多酚的最优工艺，并对不同体积分数乙醇洗脱的刺梨多酚抗氧化活性进行评价。方法：以刺梨果渣为原料，刺梨多酚的提取率为指标，在单因素试验的基础上，选择料液比、乙醇体积分数和浸提时间为自变量，刺梨多酚的提取率为响应值，作三因素三水平的响应面优化试验，研究各变量的交互作用及其对刺梨多酚提取率的影响;用DPPH法，测定不同体积分数乙醇溶液洗脱的刺梨多酚体外抗氧化能力。结果：刺梨多酚的最佳工艺参数为：乙醇体积分数43%、料液比1：24、浸提温度60℃、浸提时间45 min、超声功率270 W;不同体积分数乙醇洗脱的刺梨多酚对DPPH自由基的清除能力大小依次为40%>25%>55%>10%和70%。结论：在最优条件下刺梨多酚的提取率为37.818 mg/g，实际提取率36.597 mg/g，能达到模型预测值的96.77%，说明模型可靠;不同体积分数乙醇洗脱的刺梨多酚对DPPH自由基的清除活性与其总酚的纯度存在一定的正相关关系，40%乙醇洗脱的刺梨多酚抗氧化活性最强。

关键词：响应面;刺梨;多酚;超声提取;抗氧化

刺梨（Rosa roxburghii）是贵州省特有的药食同源植物，野生种质资源十分丰富，民间常有生食、泡酒、糖渍等习惯。刺梨果实富含有机酸和十余种氨基酸[1]、十余种对人体有益的微量元素[2]、超氧化物歧化物和维生素C[3]，具有较高的食用价值。研究表明，刺梨具有促进消化、抗氧化[4]、抗癌防癌[5]、调节机体免疫功能[6]、解毒[7]、镇静等药理活性;刺梨果实中富含的植物多酚物质，作为天然植物源性抗氧化剂在预防和治疗老年性退行性神经疾病[8]、心脏保护、免疫系统促进[9]、抗炎[10]、皮肤保护等方面逐渐受到学者的关注。

超声波辅助提取技术在天然产物活性物质提取上的应用广泛，其独有的空化效应和机械效应能增强提取中的传质过程[11]，从而提高提取率和缩短提取时间，具有高效、节能、不影响提取物结构和活性等优点[12]。本研究通过单因素试验讨论乙醇体积分数、料液比、浸提温度、浸提时间、超声功率对刺梨多酚提取率的影响，在此基础上根据Box-Benhnken中心组试验设计原理进行三因素三水平的响应面分析试验，以确定超声辅助提取刺梨多酚的最佳工艺条件，为刺梨多酚的高效分离提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺梨果渣，贵州恒力源刺梨健康产业有限公司;无水乙醇，天津市富宇精细化工有限公司;没食子酸标品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;福林酚，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;XAD-7型离子交换大孔吸附树脂，德国Amberlite;DPPH自由基，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

A11 basic基础型分析研磨机，德国IKA;标准检验筛，浙江上虞市道墟张兴纱筛厂;SB-5200 DTD型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司;UV-2800紫外可见分光光度计，美国UNICO;SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂;HH-S-4型恒温水浴锅，常州万科仪器科技有限公司;RV 10型旋转蒸发仪，德国IKA;FD-1D-50型冷冻干燥机，北京博医康试验仪器有限公司;Micro-ESR ACTIVE SPECTRUM;层析柱（Ф5cm×100cm），上海华美实验仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 刺梨多酚的提取及分离纯化 （1）刺梨多酚提取条件单因素试验：将干燥刺梨果渣中的刺梨籽筛分出来，剩余的果渣用分析研磨机磨碎后过60目筛备用。刺梨多酚提取条件的单因素试验：乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）、料液比（1：10、1：15、1：20、1：25、1：30）、浸提温度（20、30、40、50、60℃）、浸提时间（10、20、30、40、50 min）、超声功率（150、180、210、240、270 W），抽滤后将滤液转入100 mL容量瓶定容，吸取1.25 mL样液于25 mL容量瓶中，按标准曲线制作方法测定吸光度，计算总酚含量。（2）没食子酸标准曲线制作：Folin-Ciocalteus（FC）法：配置0、10、20、30、40、50 μg/mL的没食子酸标准溶液，分别取上述不同浓度标准溶液0.5 mL加入1.0 mL FC试剂，5 min后加入2 mL NaCO3（75 g/L）溶液，水浴50℃下保持5 min，室温冷却，用分光光度计测定溶液在740 nm处的吸光值。所得标准曲线为没食子酸浓度C与吸光度值A的关系。

（3）提取率的计算式（1）：

提取率（mg/g）=C×V×NW（1）

式（1）中，C为测量液总酚浓度（μg/mL）;V为粗提液体积（mL）;N为稀释倍数;W为原料质量（g）。

（4）刺梨多酚的分离纯化：将1.3.1（1）中冻干的样品配置成质量浓度5 g/L的样液，用NaOH和HCL调pH到4，按流速1 mL/min上样，直至树脂饱和，分别用蒸馏水、10%、25%、40%、55%、70%体积分数乙醇溶液洗脱，洗脱流速1 mL/min，收集洗脱液，用旋转蒸发仪将洗脱液中的乙醇蒸出，冻干得不同体积分数乙醇洗脱的刺梨多酚。

1.3.2 响应面优化试验设计 在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选择料液比、乙醇体积分数和浸提时间为自变量，刺梨多酚的提取率为响应值，作三因素三水平的响应面优化试验（表1）。

1.3.3 刺梨多酚的抗氧化活性 （1）ESR参数条件：扫场范围：3 380～3 540 G;微波功率：6 mW;模线圈振幅：3G;扫描次数：15次;扫描点数：4 096个。（2）不同浓度样品溶液的测定：分别用10%、25%、40%、55%、70%体积分数的乙醇溶液将1.3.1（4）中制得的刺梨提取物配置并稀释成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL质量浓度的样液。取不同浓度的样液50 μL，加入1 mL 0.5 mmol/L的DPPH溶液，混匀后避光静置30 min，吸入直径1 mm的毛细管，放入ESR振谐腔，记录波谱图并计算峰面积。用10%、25%、40%、55%、70%体积分数的乙醇溶液作空白对照。

清除率（%）=S0-SS0×100%（2）

式（2）中，S0为空白对照的ESR波谱峰面积、S为样液的ESR波谱峰面积。

1.4 数据处理与统计分析

采用Microsoft Excel对进行数据整理，用IBM SPSS Statistics 25.0进行图形绘制和显著性分析，Design-Expert软件进行响应面设计及优化分析。

2 结果与分析

2.1 刺梨多酚含量测定标准曲线的绘制

多酚测定标准曲线的回归方程y=0.019 6x+0.003 6（R2=0.999 9），该方程拟合度较好，可作为工作曲线表征提取液中刺梨多酚的没食子酸当量。

2.2 单因素试验分析

2.2.1 乙醇体积分数对刺梨多酚提取率的影响 在料液比1：20、浸提温度40℃、浸提时间30 min、超声功率210 W的条件下，考察不同的乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）对刺梨多酚提取率的影响，如图1A所示，乙醇体积分数在40%～80%范围内，刺梨多酚提取率随着乙醇体积分数的增加呈现出先升高后降低的趋势，在乙醇体积分数50%时，提取率最大，达34.01 mg/g，李斌等[13]在超声辅助提取蓝靛果多酚时也发现，乙醇体积分数50%时蓝靛果多酚提取率达到最大，提取率随乙醇体积分数的增大先增大后减小的原因可能与多酚的极性大小有关，另外乙醇浓度过高，在提取时易挥发，也会降低提取效果。

2.2.2 料液比对刺梨多酚提取率的影响 在乙醇体积分数60%、浸提温度40℃、浸提时间30 min、超声功率210 W的条件下，考察不同的料液比（1：10、1：15、1：20、1：25、1：30）对刺梨多酚提取率的影响，如图1B所示，在上述料液比范围内，随着料液比的增加，多酚提取率升高到32.71 mg/g，当料液比超过1：20时，继续提高溶剂比例，多酚提取率不再升高且略有下降，可能是由于在料液比1 ∶20时，刺梨多酚基本已完全溶出，再增加溶剂的比例，相当于将已溶出的刺梨多酚稀释，导致刺梨多酚浓度的降低，包善思等[14]的研究中也出现了类似的规律和结果。

2.2.3浸提温度对刺梨多酚提取率的影响 在乙醇体积分数60%、料液比1：20、浸提时间30 min、超声功率210 W的条件下，考察不同的浸提温度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃）对刺梨多酚提取率的影响，如图1C所示，在20～60℃范围内，刺梨多酚的提取率与浸提温度呈正相关关系，在60℃时提取率达37.86 mg/g，可能是由于高温增加提取物的溶解度和扩散系数，降低溶剂粘度，从而提高提取率，但是过高的温度会引起酚类化合物的降解、内部氧化还原及聚合反应，同时易造成溶剂挥发，因此选择60℃为浸提温度较为合适。

2.2.4 浸提时间对刺梨多酚提取率的影响 在乙醇体积分数60%、料液比1：20、浸提温度40℃、超声功率210 W的条件下，考察不同的浸提时间（10、20、30、40、50 min）对刺梨多酚提取率的影响，如图1D所示，在浸提时间10～40 min之内，刺梨多酚的提取率随浸提时间的延长从23.99 mg/g提高到32.30 mg/g，继续延长浸提时间，提取率出现下降的趋势，这可能是由于刺梨多酚在40 min后不再溶出，延长浸提时间会使溶出的多酚氧化分解，含量减少;其次可能是由于超声的热效应，长时间的超声处理导致热敏性组分的降解。

2.2.5 超声功率对刺梨多酚提取率的影响 在乙醇体积分数60%、料液比1：20、浸提温度40℃、浸提时间40 min的条件下，考察不同的微波功率（150、180、210、240、270 W）对刺梨多酚提取率的影响，如图2E所示，在一定范围内，刺梨多酚提取率随超声功率的增大而升高，可能是由于超声波在提取溶液中产生的空化效应和机械作用使植物细胞壁破裂，促进有效成分的溶出，因此选择270 W为超声浸提功率。曹艳华等[15]的研究中显示，超声功率对洋葱多酚得率的影响显著，在350 W时，洋葱多酚提取率最大，继续提高功率，提取率将下降。

2.3 刺梨多酚的分离纯化

用10%、25%、40%、55%、70%体积分数乙醇溶液对树脂进行洗脱，将洗脱液中乙醇蒸出冻干后得到的不同体积分数乙醇洗脱的刺梨多酚，其纯度分别为48.45%、81.24%、93.28%、75.30%、67.82%。

2.4 超声辅助刺梨多酚提取工艺响应面优化试验

2.4.1 响应模型的建立与分析 响应面分析法常用Box-Behbken设计在多因素系统中寻找最优条件，通过Design-Expert软件对表2中数据进行二次回归分析可得多元二次响应面回归方程如式（3）：

刺梨多酚提取率Y（%）=42.86+1.21A-1.22B+3.19C-1.65AB-0.7024AC+0.3632BC -1.44A2-7.00B2+0.2173C2（3）

从表3可以看到，该回归模型P=0.002 0<0.01，模型极显著，确定系数R2=0.936 6，矫正确定系数R2Adj=0.855 1>0.8，说明该模型与实际值拟合程度较好，变异系数CV=4.64%<10%，说明试验可信度和精确度高，可用来分析和预测刺梨多酚的提取率的工艺参数。对回归模型进行显著性检验可知，C、AC和B2对响应值的影响显著，其中C和B2对响应值的影响极显著，其他因素影响不显著，根据F值可看出，各因素对刺梨多酚提取率的影响依次为：浸提时间>料液比>乙醇体积分数。

2.4.2 两因素交互作用响应面分析 为了进一步探究各因素之间的交互作用，根据回归方程绘出等高线图和响应面。通过响应面的变化情况可直观反映两因素对刺梨多酚提取率的影响以及其对自变量的敏感程度，等高线形状和稀疏程度可反映两因素交互作用的强弱，扁圆形或马鞍形则交互作用显著，圆形则表示交互作用不显著。由图2可以看出，乙醇体积分数50%时，刺梨多酚的提取率最高，乙醇体积分数和料液比对刺梨多酚提取率的影响较大，料液比曲面比乙醇体积分数曲面变化更陡峭，等高线更密集，说明刺梨多酚提取率对料液比的变化更敏感，与方差分析的结果相一致。