SPE净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中四环素类抗生素残留量

四环素类抗生素（Tetracyclines）主要指土霉素（oxytetracycline）、四环素（tetracycline）、金霉素（chlortetracycline）、强力霉素（doxycycline）4种，是一类广谱抗生素，能有效抑制蛋白质的合成，对于治疗动物细菌传染病效果显著，在水产养殖、禽畜养殖等行业有着广泛应用，但却极易造成动物体内药物严重过剩，并随食物链富集，直接或间接对人体造成毒性危害、致畸致癌及其他严重性疾病。因此，四环素类抗生素的用量和用药期应受到严格管控。我国对于四环素类抗生素允许残留在猪肉中的浓度标准有着明确规定，其中，土霉素、四环素、金霉素均为200µg/kg，强力霉素（多西环素）为100µg/kg。

四环素类抗生素样品检测的前处理过程常采用固相萃取、液液萃取、固相微萃取等前处理方式。其中，固相萃取的应用最为广泛，但传统固相萃取柱常采用“等密度法”来填装，选用聚乙烯材质的注射针筒装置为骨架，在装置内上下装有两片聚乙烯或玻璃纤维材质的塞片，并在塞片中间装填一定量的色谱吸附剂（填料），填料要求准确且混合均匀，对填料密度的要求也较高。因此，传统固相萃取柱填料法操作繁琐，对人员的技术能力要求较高，且填完的固相萃取柱重复性较低。本文选择市售成品净化柱，采用SPE净化、液相色谱质谱法检测，建立了简单、快捷地检测4种四环素类抗生素的分析方法。

1. 材料与方法

1.1 材料与试剂

土霉素（CAS：6153-64-6，GSB05-3333-2016）、四环素（CAS：60-54-8，GSB05-3334-2016）、金霉素（CAS：57-62-5，GSB05-3332-2016）、强力霉素（CAS：564-25-0，GSB05-3335-2016），标准物质浓度均为100μg/mL，农业部环境保护科研检测所；甲醇，色谱纯，科密欧；甲酸，色谱纯，科密欧；乙酸乙酯，色谱纯，科密欧；乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）、柠檬酸（C5H8O7·H2O）/磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O），优级纯，科密欧；实验用水，杭州娃哈哈集团有限公司；SelectCore HLB净化柱，60mg/3mL，苏州纳谱；猪肉粉中四环素、土霉素、金霉素分析质控样MCS-80165。

1.2 仪器与设备

赛默飞液相色谱质谱仪，TSQ Fortis；pH计，上海雷磁仪器；TGL-16高速冷冻离心机，卢湘仪；ME204E/JY20002天子天平，梅特勒托利多集团；HY-2涡旋混匀仪，上海雷磁仪器；SK7200HP超声清洗机，上海科导超声仪器有限公司；移液器（1mL/200µL），Eppendorf；自动进样小瓶，棕色2mL，艾杰尔科技有限公司；自动氮吹浓缩仪，M10，北京莱伯泰科仪器股份有限公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 标准溶液的配制。用移液器准确移取四种标液各10µL于进样小瓶中，再加入960µL的0.1%甲酸水溶液定容至1mL，配置成1µg/mL的混合标准工作溶液。按照需求配置成2、5、10、20、40µg/L系列混合标准工作溶液，现用现配。

1.3.2 试剂的配制。0.1%甲酸水：量取100µL甲酸与100mL水混合；20%甲醇水：量取20mL甲醇与80mL水混合；5%甲醇水：量取5mL甲醇与95mL水混合；甲醇+乙酸乙酯（1+9）：量取10mL甲醇与90mL乙酸乙酯混合；Na2EDTA-Mellvaine缓冲液为1625mL Mellvaine，在缓冲液中加入60.5g的Na2EDTA，混匀溶解。

备注：Mellvaine缓冲液配制方法为先称取21.02g柠檬酸（C5H8O7·H2O）溶于1000mL水中，另称取28.41g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）溶于1000mL水中，将1000mL柠檬酸溶液与625mL磷酸氢二钠溶液混合，用氢氧化钠或者盐酸溶液调节pH至4.0±0.05。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件。纳谱分析，ChromCore C18（2.1×100mm，3.0µm）色谱柱；柱温为30℃；流动相A为添加0.1%甲酸的水溶液，流动相B为甲醇。梯度洗脱：0-1.0min，20%B；1.0-4.8min，20%B-95%B；4.8-5.7min，95%B；5.7-6.0min，95%B-20%B。流速为0.35mL/min，进样量为5µL。

1.4.2 质谱条件。电喷雾电离源为电离模式ESI+；扫描模式为多反应监测（SRM）；鞘气压力Sheath Gas Flow Rate 35units；辅助气压力Aux Gas Flow Rate 15units；喷雾电压Spray Voltage 4500V；离子传输管温度Capillary Temp 350℃；加热器温度Heater Temp 0℃；碰撞气Collision gas pressure（Ar）1.5mTorr。4种四环素类化合物SRM模式质谱优化参数如表1所示。

1.5 样品前处理

在50mL离心管（聚丙烯材质）中称取均匀样品5g（精确至0.01g），分别用冰水浴超声提取两次，且每次提取液（1.3.2）用量为20mL，提取完成后涡混1min，超声提取10min，在温度低于5℃下时以4000r/min的转速离心5min，合并上清液，并用提取液（1.3.2）定容至50mL，收集经快速滤纸过滤的滤液。

自然流速下，依次用甲醇活化HLB柱、实验用水平衡净化柱；取10mL样液过柱后，依次用实验用水（5mL）、5%甲醇水溶液（5mL）淋洗净化柱，减压（2.0KPa以下）抽干5min；用10mL甲醇+乙酸乙酯（1+9）溶液洗脱净化柱，收集洗脱液，在40℃下氮气吹至近干。用1mL的20%甲醇水定容，过0.22µm针孔混合纤维素滤膜，上机测定。

1.6 结果计算

具体的计算公式如下：

在上式中，w为样品含量，µg/kg；c为待测组分溶液的质量浓度，µg/L；V1为样品定容体积，mL；V2为净化样品溶液体积，mL；m为试样称样量，g。

2. 结果与分析

2.1 提取方法的优化

四环素类药物分子中含有许多羟基、烯醇羟基及羰基，在近中性条件下能与多种金属离子形成不溶性螯合物，例如与钙或镁离子形成不溶性的钙盐或镁盐、与铁离子形成红色络合物、与铝离子形成黄色络合物等，导致提取不彻底，需采用Na2EDTA-Mellvaine缓冲液进行提取，并将乙二胺四乙酸二钠作为氨基羧酸类螯合剂。乙二胺四乙酸二钠含有两个氮原子和四个氧原子，可提供形成配位键的电子对，并与钙离子形成六个配位键组成的K元环，极大增强螯合剂分子与金属离子的强结合作用，从而将金属离子包合到螯合剂内部，形成稳定且分子量更大的化合物，阻止金属离子与四环素类药物的螯合，提高准确率。

此外，猪肉样品基质含有大量脂肪、蛋白质、碳水化合物以及钙、铁、磷等微量元素，样品中目标物残留浓度也较低，不宜采用常规的快速筛查方法。HLB固相萃取柱能够去除95%的常见基质干扰物（如磷脂、脂肪、盐和蛋白质等），使目标物得到浓缩富集，提高检测的灵敏度。

2.2 方法学评价

2.2.1 线性关系及检出限。按1.3.1配制系列标准工作溶液，在相应色谱（1.4.1）和质谱条件（1.4.2）下进行检测，以溶液质量浓度（µg/L）为横坐标、色谱峰面积为纵坐标，进行线性回归。结果表示，在2-40µg/L范围内，各物质线性良好，线性相关系数（R2）为0.9991-0.9996。以3倍信噪比时对应的质量浓度为方法检出限（LOD），10倍信噪比时对应的质量浓度为定量下限（LOQ），结果如表2所示。

2.2.2 方法回收率及精密度。以阴性猪肉样品为基质，进行三个水平的加标实验（添加浓度为5、10、20µg/kg），计算n=6时的平均回收率和相对标准偏差，结果如表3所示。在质量浓度为5、10、20µg/kg的添加水平下，加标回收率分别为四环素116%-123%、土霉素115%-119%、金霉素92.4%-98.9%、强力霉素80.2%-104%，相对标准偏差分别为四环素1.8%-4.6%、土霉素1.1%-6.3%、金霉素2.2%-5.6%、强力霉素1.6%-4.5%。

2.2.3 实际样品检测。为更好验证方法的适用性，随机从市场选取10批猪肉及购买质控样品进行检测。其中，市场样品均未检出，质控样品检出，检测结果准确。

3. 结论

本文采用固相萃取-液相色谱质谱法测定猪肉中四环素类抗生素残留量，实现了4种常规四环素类抗生素药物的同时分析。前处理采用HLB净化、浓缩去除猪肉大部分的脂肪和蛋白物质，提高了检测的灵敏度，在筛查和定量检测四环素类抗生素方面具有一定的准确性和稳定性。

作者简介：郑连港（1989-），男，汉族，山东潍坊人，中级工程师，大学本科，研究方向为质量工程。