高效液相色谱法测定食品中脱氢乙酸含量的方法优化

脱氢乙酸是一种呈白色或略微淡黄色的结晶性颗粒状粉末，是一种低毒、高效的防腐和防霉剂，在酸、碱等环境下具有一定的抗菌功能，尤其对霉菌的抑制效果最为显著，但过量摄入可能对身体造成一定危害，所以我国仅允许在部分食品中使用。根据《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121-2016），液相色谱法的前处理过程相对复杂，不同基质需要不同的处理方法，且在进样后可能出现色谱峰拖尾的问题。为了简化操作流程并优化峰型对称性，本研究在GB 5009.121-2016标准的基础上进行了一系列优化实验，通过简化流动相比例和调整不同基质的前处理方法，可以使实验操作更加简单，峰型也更加对称。

在实验中，样品溶解均匀后，通过氢氧化钠提取脱氢乙酸；经过前处理，通过水相滤膜，使用高效液相色谱仪（同时配备紫外检测器）进行测定。在优化的条件下，该方法的检出限为0.002g/kg，定量限为0.005g/kg；在1.00-200μg/mL范围内，脱氢乙酸质量浓度的响应值和峰面积之间存在良好的线性关系，R2为0.9998；0.015、0.025、0.050g/kg三个水平的加标回收率为98.3%-103.2%。另外，对于具有不同基质的样本，可以使用统一的预处理技术，实现对各种基质样本的同步处理，从而提升检测效率。

1. 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器。Ultimate3000液相色谱仪，赛默飞世尔科技术有限公司；BSA 423S电子天平，德国赛多利斯公司；FXP 20M超声波清洗器，Unisonics Australia；BE-2600涡旋震荡混合器，林贝尔仪器制造有限公司；FE20实验室pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.1.2 试剂。乙酸铵，默克化工技术（上海）有限公司；高品质纯氢氧化钠，国药集团；硫酸锌，默克化工技术（上海）有限公司；色谱纯甲醇，美国默克公司；氨水，永华化学股份有限公司；超纯水，上海和泰仪器有限公司；0.45μm水相滤膜，上海安谱实验科技股份有限公司；脱氢乙酸（Dehydroacetic acid）标准品，BePure公司。以上这些试剂的纯度都超过99.9%。

为制备标准储备液，准确称取0.050g脱氢乙酸标准品，溶解于20g/L的氢氧化钠溶液中，然后用水定容至50mL，最终得到质量浓度为1.0mg/mL的标准储备液。标准工作液则通过逐级稀释标准储备液得到，质量浓度分别为1、10.0、50.0、100、200μg/mL。

1.2 仪器工作条件

使用DikMA Silversil 5μm C18色谱柱，尺寸为250mm×4.6mm，柱温设定在35℃。实验中的进样量为10μL，流速为1.0mL/min。检测波长为293nm，进样时间为22min。流动相是由乙酸铵溶液（浓度为0.02mol/L）和甲醇混合而成。

1.3 样品处理方法

将2g试样放入50mL玻璃比色管中，加入25mL超纯水，涡旋混合1min，超声提取30min以上，然后再次涡旋混合1min。加入5mL浓度为120g/L的ZnSO4溶液，用浓度为20g/L的NaOH溶液调节pH至7.5，再用水定容至50mL，然后摇匀。通过滤纸过滤，取得澄清的滤液，通过0.45μm的水相滤膜过滤后上机测定。

2. 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择。通过使用UVD紫外检测器和3D光谱图，确定脱氢乙酸吸收峰的最大波长分别是230nm和293nm，但在230nm的位置，杂质干扰较为明显，而在293nm的位置，杂质干扰则相对较少。为了确保测量的准确性，选择293nm作为检测波长，这与GB 5009.121-2016所规定的波长是一致的。

2.1.2 流动相梯度洗脱比例的选择。脱氢乙酸对抗酵母菌和霉菌的功能卓越，在面包、糕点以及发酵食品等多个行业中得到了广泛的应用。考虑到这类食品通常会混合多种食品添加剂，为了确保样本中那些性质差异较大的成分能够有效分离并达到洗脱后的清洁效果，实验中选择了梯度洗脱技术，梯度洗脱的比例详见表1。

表1：梯度洗脱比例

2.1.3 流动相pH的选择。在一致的实验设备环境中，对质量浓度达到50.0μg/mL的脱氢乙酸样本进行取样，并据此绘制相应的对照图表。在具体实验过程中，使用氨水将0.02mol/mL的乙酸铵调整pH至9.0，设定初始流动相比例为：甲醇-0.02mol/mL乙酸铵（体积比为1：49）。接着，采用表1中的梯度洗脱技术，得到流动相进样图谱，如图1所示。

图1：初始的流动相比例为甲醇-0.02mol/mL

乙酸铵（体积比为1：49）的流动相进样图谱

2.2 线性关系

当标准品的质量浓度处于1.0-200.0mg/mL时，其响应值表现出色，峰面积之间也展现出明显的线性关联。线性方程的公式是y=0.4839x，其相关系数R2达到0.9998。另外，检测的下限是0.002mg/kg，定量的下限则是0.005mg/kg。

2.3 不同方法的回收率

依据GB 5009.121-2016的第二种方法，也就是液相色谱法中的样品制备和提取过程，我们可以观察到国家标准对于不同的基质都有不同的预处理策略。为了使操作更为简洁，我们简化了前处理流程，以便对各种基质的样本进行统一处理。在实验过程中，选择果蔬汁、豆制品和糕点作为主要的试验材料，并加入脱氢乙酸作为标准样品，接着根据国标方法和优化后的试验方法进行前期处理，然后进行样品进样。不同基质不同方法的加标回收率如表2所示。

2.3.1 果蔬汁处理方法。在国标法中，样本先被称重到离心管中，接着需要调整pH，再将其转移到容量瓶中进行定容，然后置入离心管中进行离心操作，在取得上清液之后，再次调整pH并进行定容。接下来，取5mL样本，并通过固相萃取柱收集洗脱液，然后进行上机测试。在这个预处理步骤中，多次的转移和固相萃取柱的应用都有可能引发损失。与此相对照，我们在实验过程中对前处理进行了优化，只需在比色管中直接称量样本，并在加入沉淀剂后使用比色管进行定容。这种方法减少了多次转移和固相萃取柱的净化过程，从而有效地提升了回收效率。根据数据分析，与优化后的方法相比，国标法的回收效率明显较低。

2.3.2 豆制品处理方法。按照国标法，先在离心管里取样，再将其转移到容量瓶中进行容量测定，接着进行超声波提取和过滤，然后进行机器测试，其回收效率高达99%。在实验过程中，我们优化了前处理步骤，并成功实现了100%的回收率。当回收率的差异不显著时，实验的预处理步骤变得更加简单和便捷。

2.3.3 糕点处理方法。按照国标法，先将样本溶解，再加入沉淀剂并进行定容处理，接着必须把溶液转移到分液漏斗里，用正己烷多次抽提之后，取水相层进行离心，然后用过滤膜对上清液进行测量。当高效液相色谱的分离效果不尽如人意时，需要调整上清液的pH，再利用固相萃取柱进行进一步处理，并在洗脱后进行机器测试。从表2中可以观察到，采用国家标准的萃取方法后，回收效率已经降低，但经过固相萃取柱的处理，损失变得更加明显；与此相对照，使用经过优化的前处理技术，其回收效果更为出色。

2.4 方法优化后的精密度与回收率

经过对蔬菜汁、腐乳和糕点样本的筛选，我们在3、5和10倍的定量限制内完成了加标回收操作，在0.015、0.025、0.050g/kg这三个浓度加入了脱氢乙酸，并采用了优化过的预处理技术进行提取和测量。在每一种添加水平下进行6轮的平行测量，并据此估算其回收效率和精确性。实验数据显示，平均回收率为98.3%-103.2%，标准相对标准偏差（SRSD）为0.35%-2.35%。

2.5 质控样检测

在执行质量控制过程中，我们选择了糕点里的脱氢乙酸作为质控样本。如表3所示，在经历了试验中的预处理阶段之后，测定的上机值达到0.261g/kg。当将其转化为质量控制的参考值时，得到的结果是0.265g/kg，且回收效率高达98.49%。基于试验方法的检测数据，我们可以得到令人满意的结论，这些数据进一步验证了该方法的高度准确性。

3. 结论

为了更有效地提取和分析食品中的脱氢乙酸，本实验基于国家标准进行了相应的优化工作，利用高效液相色谱技术成功分离和测定了脱氢乙酸。该方法不仅展示了出色的精确性和回收效率，还具有出色的线性关联。令人惊喜的是，在处理不同基质的样本时，我们使用了一致的预处理技术，实现了对各种基质样本的同步处理。这种方法不仅提高了实验室检测效率，对于那些需要完成繁重检测任务的第三方检测机构而言，更是能够节约大量时间和人力成本。

作者简介：周全（1996-），男，汉族，湖南人，初级工程师，大学本科，研究方向为食品安全理化检测方法优化。