玉竹多糖的体内外抗氧化活性分析

自由基是人体环境中一种基本的新陈代谢产物，并保持在某一个生理动态的自然平衡体系中，当人体这个正常平衡系统被完全打破时，就可能引发很多潜在的健康疾病，比如炎症、衰老性疾病和急性胃肠道炎症等。天然植物多糖具有很好的抗氧化活性，一方面能够直接清除大量自由基，有助于控制机体的氧化应激反应。另一方面能够通过直接或者间接调节一系列人体细胞自身的生理机制与其他生化或代谢生物学机制，间接调节超氧化物歧化酶（SOD）的生物活性量、过氧化氢酶（CAT）的生理活性量和超氧化物谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的生物活性量或者是其它抗氧化的活性类物质酶的活性量，从而有效清除人体组织内长期积累沉淀下来的过量的生物活性氧（ROS）等，提高人体面临严酷的自然逆境变化时的生理适应和应答能力等。

玉竹（Polygonatum odoratum（Mill.）Druce）是一种具有丰富药用价值的药食同源性植物，而玉竹多糖是玉竹中最主要的药效成分，具有显著的抗癌、降糖、抗氧化等功效。本研究以团队前期提取得到的玉竹多糖为研究对象，从体内外研究其抗氧化性能，为玉竹多糖的进一步开发利用提供了参考。

一、材料与方法

1.主要材料与试剂。在此之前，我们团队对玉竹进行了多糖的分离提纯，最终得到纯化的玉竹多糖，用苯酚硫酸法测定得到的样品中的可溶性总脂糖含量大约为61%。DPPH，美国Sigma公司；过氧化氢酶（CAT）、超氧化物谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）和总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒，南京建成公司。

2.动物。雄性SD大鼠30只，4周龄，采购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

3.方法。（1）玉竹多糖的体外抗氧化活性分析。①玉竹多糖对DPPH自由基的清除作用。DPPH自由基清除能力的测定参照课题组前期王艳等的方法。用50%的乙醇配制0.1mmol/L的DPPH溶液和0mg/mL-1mg/mL的维生素C（VC），在1.8mL的DPPH溶液中分别加入0.2mL的VC和不同浓度的玉竹多糖（1mg/mL-10mg/mL），混匀后反应30min，测量其在517nm处的吸光度Ai；将样品替换为4.0mL纯水后，获得吸光度Ac，用50%乙醇代替DPPH，获得吸光度Aj；以VC为阳性对照，各个样品进行3次平行检测，玉竹多糖对DPPH自由基的清除率按下方公式进行计算。

②玉竹多糖对羟自由基的清除作用。羟自由基清除能力的测定参照Chen等的方法，步骤如下：将5mL不同浓度的VC和不同浓度的玉竹多糖（1mg/mL-10mg/mL）放入试管中，再将0.6mL的5mM邻二氮菲、5mL的200mM磷酸缓冲液（pH=7.4）和0.4mL的7.5mm FeSO4溶液加入试管中混合均匀，然后加入0.2mL浓度为30%的H₂O₂，补纯水至总体积为10.0mL后，37℃水浴40min，最终测定其在波长510nm处的吸光度，并按下方公式计算玉竹多糖对羟自由基的清除率。

在上述公式中，A样品为含玉竹多糖和H₂O₂混合物的吸光度，A损伤为含H₂O₂混合物的吸光度，A未损伤为含玉竹多糖混合物的吸光度。

③玉竹多糖还原能力的测定。采用邻苯三酚自氧化法，测定超氧阴离子自由基的清除率。将0.5mL的0.2M磷酸盐缓冲剂（pH6.6）及1.5mL浓度为0.3%的K3Fe（CN）6依次加入试管中，与不同浓度的玉竹多糖（1mg/mL-10mg/mL）混合后，于50℃条件下反应20min，再加入1mL浓度为10%的TCA，然后开始离心。将2mL上清液与0.5mL浓度为0.3%的FeCl₃溶液混合，10min后测定波长700nm处的吸光度，即为玉竹多糖的还原能力。

（2）玉竹多糖的体内抗氧化活性分析。①实验动物的饲养和喂养。30只雄性SD大鼠被随机分成3组，即营养正常膳食组（NC，n=10）、高脂膳食组（HF，n=10）和玉竹多糖膳食组（PSP，n=10）。营养正常膳食组给予正常的饮食及处理，高脂膳食组喂食高脂饮食，玉竹多糖组按剂量400mg/kg给药。NC和HF灌胃相应体积的生理盐水，造模8周后，给药6周，最后空腹过夜，采用戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，取大鼠腹主动脉血中的大鼠血清，于-80℃冷藏，以备之后再用。②玉竹多糖对高脂膳食大鼠血液抗氧化酶系统的影响。SOD、CAT和GSH-Px酶活及MDA的含量均按相应的试剂盒说明书进行测定。

二、结果与分析

1.玉竹多糖对DPPH自由基的清除作用。由图1可知，当玉竹多糖的浓度为1mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率为14.06%，相当于同浓度下VC清除率的20%，且其作用呈剂量依赖性，当玉竹多糖的浓度为10mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率高达42%。该结果表明，玉竹多糖是一种很好的DPPH清除剂。

2.玉竹多糖对羟自由基的清除作用。从图2分析可知，玉竹多糖对羟自由基的直接清除氧化能力也呈剂量依赖性，随着玉竹多糖浓度的增加，清除率相应上升，具有相对较强的选择性抗氧化反应活性。当玉竹多糖的浓度为1mg/mL时，其对羟自由基的清除率为11.87%。以VC作为阳性对照，其对羟自由基的清除能力达到74.14%，明显好于玉竹多糖。当玉竹多糖的浓度达到10mg/mL时，其对羟自由基的清除率达到33.48%，这说明玉竹多糖的确是另外一种功能相对弱一些的羟自由基清除剂。

3.玉竹多糖的还原能力测定。多糖的抗氧化活性与还原性密切相关，从图3可以看出，玉竹多糖和VC都具有清除超氧阴离子自由基的功能，并且呈现出了剂量依赖性，即浓度剂量越大，清除功能越强。但是在同样的浓度条件下，VC的还原能力明显高于玉竹多糖。当VC浓度为1mg/mL时，其还原能力达到2.42±0.084。此时，玉竹多糖的还原能力为0.45±0.032，仅占VC的18.59%，这表明玉竹多糖具有较弱的还原能力。

4.在长期高脂膳食条件的诱导下，玉竹多糖对大鼠血液蛋白中的CAT、SOD、GSH-Px活性及血清MDA含量水平的影响。由表1可知，高脂膳食HF组的CAT、SOD和GSH-Px均明显低于NC对照组（P＜0.05），MDA含量则明显高于NC对照组（P＜0.01）。但经玉竹多糖灌胃4周后，可以显著提高HF组的抗氧化酶活性（CAT、SOD和GSH-Px，P＜0.01），并且显著降低MDA含量（P＜0.05），表明玉竹多糖能够提高肝脏修复高脂膳食引发的氧化损伤的能力。

三、结论与讨论

玉竹多糖是药食同源性植物玉竹的主要活性物质，在本研究的体外抗氧化活性实验中，我们进一步证实了玉竹多糖对DPPH自由基和羟自由基具有较强的清除作用和一定的还原作用。

抗氧化酶系统SOD、CAT和GSH-Px在逆境胁迫响应中起到了重要作用。当机体遭受逆境胁迫时，其能够利用一系列生理生化机制，对这些酶类的活性进行调控，或者是对抗氧化类物质的量进行调控，从而将体内过量积累的ROS清除掉，以此来提升机体的逆境适应能力。相反，如果其抗氧化酶活性下降，就会导致自由基损害人体。我们在体外实验的基础上，以高脂膳食肥胖大鼠为研究对象，观察了玉竹多糖的体内抗氧化活性，研究结果表明，高脂膳食大鼠被玉竹多糖灌胃6周后，血清中SOD、GSH-Px和CAT水平明显上升，说明玉竹多糖可以通过上调主要的抗氧化酶的活性来增强抗氧化防御系统，以应对高脂膳食诱导的氧化应激反应。

高脂膳食后ROS过度积累可导致生物膜脂质过氧化反应，而脂质过氧化会导致细胞膜的流动性下降、通透性增加，导致胞质蛋白丢失。因此，抑制脂质过氧化对维持正常的细胞功能至关重要。MDA是用来衡量膜脂质过氧化反应程度大小的又一项重要指标，也可以反应生物体膜脂质过氧化反应的难易程度。在本研究中，玉竹多糖显著降低了高脂膳食大鼠的MDA水平，说明玉竹多糖可以有效减弱脂质过氧化。

基金项目：湖南省自然科学基金项目“亮白曲谷氛酸脱气酶（ACGDH）提高水稻耐旱性的作用机理研究”（2021JJ40057）；2019年国家级大学生创新创业训练计划项目“玉竹多糖对高脂膳食大鼠生殖功能的影响”（201910553013）。

作者简介：王修强（2003-），男，汉族，湖南娄底人，大学本科在读，研究方向为天然产物开发与利用。

何丽丽（2004-），女，汉族，湖南衡阳人，大学本科在读，研究方向为天然产物开发与利用。

金晨钟（1964-），男，汉族，湖南娄底人，教授，大学本科，研究方向为植物保护。

胡一鸿（1965-），男，汉族，湖南娄底人，教授，博士，研究方向为植物生理。

通信作者：王艳（1985-），女，汉族，湖南娄底人，讲师，博士，研究方向为天然产物开发与利用。