大鲵皮胶原蛋白的提取及特性研究

作者: 周艳华 郏修齐 王建文 罗庆华

大鲵皮胶原蛋白的提取及特性研究0

大鲵,又称娃娃鱼,为国家二级保护动物,野生大鲵禁止捕杀。随着养殖技术不断推进,大鲵养殖产业不断发展,目前已达到较大规模。大鲵养殖业的发展也催生了一批专门从事大鲵加工的企业,并在大鲵加工过程中产生了大量加工副产物——大鲵皮。大鲵皮富含蛋白质等营养物质,特别是其含有的胶原蛋白应用范围广泛,包括食品、化妆品、生物医药等,因此研究大鲵皮的开发利用具有重要的现实意义。

现有的研究一般采用新鲜湿态的大鲵皮来提取胶原蛋白,但湿态的大鲵皮容易滋生细菌等微生物,所以作者在前期研究工作中创新采用干制大鲵皮粉提取胶原蛋白。大鲵皮经干燥粉碎后,在提取过程中提高了物料接触的比表面积,提取率更高,还可实现异地加工,降低物流成本等,为大鲵皮胶原蛋白的开发利用提供了坚实的基础。本文在此基础上研究了大鲵皮胶原蛋白的提取及特性研究,以拓宽大鲵皮的开发利用领域。

一、材料与试剂

大鲵皮,张家界金鲵生物股份有限公司;羟脯氨酸标准品、小牛键Ⅰ型胶原,美国Sigma公司;透析袋,上海源叶生物科技有限公司;胃蛋白酶(1200U/g)、乙酸、氢氧化钠、正丁醇、溴化钾、氯胺T、甲醛等,国药集团化学试剂有限公司。

二、仪器与设备

AR-2140电子分析天平,美国奥豪斯仪器(上海)有限公司;1-4LD型冷冻干燥机,德国ALPHA公司;Avanti J-26XP冷冻离心机,美国Beckman Coulter公司;pHS-3C型精密pH计,上海雷磁仪器厂;DK-98-11A恒温水浴锅,天津市泰斯特仪器有限公司;SHA-B水浴恒温振荡器,常州国华电器有限公司;FYL-C020E料理机,九阳股份有限公司;FW100万能粉碎机,天津泰斯特仪器有限公司;NEXUS-470傅立叶红外光谱仪,Nicolet Instrument Corp;UV1800紫外可见分光光度计,上海美谱达仪器有限公司。

三、实验与方法

1.干制大鲵皮胶原蛋白的提取。参照《干制大鲵皮胶原蛋白提取工艺优化》(周艳华等)的方法提取干制大鲵皮中的胶原蛋白,提取纯化后的胶原蛋白呈白色海绵状。

2.大鲵皮胶原蛋白的圆二色谱(CD)分析。准确称取一定量的大鲵皮胶原蛋白冻干品,以0.5mol/L的乙酸溶液为溶剂,将大鲵皮胶原蛋白配制成质量浓度为0.1mg/mL的蛋白溶液。将适量蛋白溶液注入光径为1mm的石英池中,在注入过程中要防止蛋白溶液产生气泡,如果产生气泡就要重新注入。采用圆二色谱仪(型号为JASCO J-810)在波长190-250nm处对蛋白溶液进行扫描,重复扫描3次,扫描速率为100nm/min。

3.大鲵皮胶原蛋白的氨基酸组成分析。取一定量的大鲵皮胶原蛋白样品,在减压充氮的条件下,采用6mol/L的HCl对蛋白样品进行水解,水解温度为110℃,水解时间为24h。水解完全后,使用氨基酸自动分析仪对蛋白样品进行检测。

4.大鲵皮胶原蛋白的吸水性测定。准确称取1.000g大鲵皮胶原蛋白样品,均匀平铺于干燥并已预先称重的培养皿中,再将其置于温度40℃、相对湿度67%的恒温恒湿生化培养箱中进行测定。每隔6h测量一次培养皿的质量并记录为m1,直到培养皿的质量不再增加时停止测定,此时培养皿的质量为m2。吸水性公式如下:

吸水性(g/g)=

5.大鲵皮胶原蛋白的保水性测定。准确量取0.5%的大鲵皮胶原蛋白溶液1mL于培养皿中,摇匀,置于温度40℃、相对湿度19%的恒温恒湿培养箱中,每隔10min测量一次大鲵皮胶原蛋白溶液的水分残存率。同时采用明胶进行对比试验,具体试验方法与大鲵皮胶原蛋白溶液相同。

6.大鲵皮胶原蛋白的乳化能力测定。本试验采用浊度法测定大鲵皮胶原蛋白的乳化能力,操作过程参考《可溶性鸡蛋壳膜蛋白与多肽的制备及其抗氧化活性的研究》(周艳华)。

7.大鲵皮胶原蛋白的起泡能力和泡沫稳定性测定。参照《可溶性鸡蛋壳膜蛋白与多肽的制备及其抗氧化活性的研究》(周艳华),测定大鲵皮胶原蛋白的起泡能力和泡沫稳定性。

四、结果与分析

1.大鲵皮胶原蛋白的纯化试验结果。将提取所得的大鲵皮胶原蛋白溶液,经等电点沉淀,透析,取出。然后利用聚乙二醇对其进行浓缩,最后经过冷冻干燥得到大鲵皮胶原蛋白。大鲵皮胶原蛋白呈絮状,颜色洁白,属于纤维蛋白。

2.圆二色谱分析。大鲵皮胶原蛋白的圆二色谱(CD)如图1所示。由图1可知,大鲵皮胶原蛋白在波长196nm左右处有1负峰,与胶原蛋白的负峰一般出现在波长198nm左右相一致,表明提取得到的大鲵皮胶原蛋白具有典型的胶原蛋白三股螺旋结构的CD图谱特征峰型。因此,CD图谱也进一步表明了用此法制备的大鲵皮胶原蛋白具有较完整的蛋白质二级结构。

3.大鲵皮胶原蛋白的氨基酸组成分析结果。大鲵皮胶原蛋白的氨基酸组成测定结果如表1所示。由表1可知,大鲵皮胶原蛋白中的甘氨酸含量最高,约占总氨基酸的1/3,与胶原蛋白的结构呈现Cly-X-Y重复排列这一结构特征相一致,说明从大鲵皮中提取得到的蛋白质是胶原蛋白。除了甘氨酸之外,脯氨酸的含量也较高,达到了33.92%,再次印证了所提取得到的蛋白质为胶原蛋白。此外,大鲵皮胶原蛋白中还含有组氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸等具有明显抗氧化活性的功能性氨基酸,由此可以推测大鲵皮胶原蛋白可能具有较强的抗氧化活性。

4.大鲵皮胶原蛋白的吸水性测定结果。吸水性是指样品吸附或摄取水分的能力,一般用每单位样品吸附水分的克数来表示。本试验将大鲵皮胶原蛋白置于温度40℃、相对湿度67%的条件下,测得大鲵皮胶原蛋白的吸水性为0.072g/g,而明胶的吸水性为0.050g/g,表明大鲵皮胶原蛋白具有较好的吸水性。

5.大鲵皮胶原蛋白的保水性测定结果。保水性是指样品保持水分的能力,一般用水分残存率来表示。大鲵皮胶原蛋白和明胶在温度40℃、相对湿度19%条件下测得的不同时间段的水分残存率如图2所示,由图2可知,大鲵皮胶原蛋白在一定条件下具有较强的保水性,且其效果优于明胶。

图2:大鲵皮胶原蛋白及明胶水分残存率曲线

6.大鲵皮胶原蛋白的乳化能力测定结果。乳化性是指样品将油和水两种不同物质结合在一起形成乳状液的能力,溶液的pH、温度和蛋白质的浓度等都会影响蛋白质的乳化性。本试验测得大鲵皮胶原蛋白的乳化性EAI为7.86m2/g pro,而明胶为6.50m2/g pro,表明大鲵皮胶原蛋白具有较好的吸水性能,原因可能是大鲵皮胶原蛋白的相对分子质量较大,有利于其在油-水界面的扩散和吸附。

7.大鲵皮胶原蛋白的起泡能力与泡沫稳定性测定结果。起泡性是指样品经搅打后产生泡沫的能力,泡沫稳定性则是指搅打停止后在不同时间内泡沫保持稳定的能力。大鲵皮胶原蛋白和明胶的起泡性与泡沫稳定性试验结果如图3所示,由图3可知,大鲵皮胶原蛋白的起泡能力与泡沫稳定性均优于明胶,在蛋糕等糕点食品中具有广阔的应用前景。

图3:大鲵皮胶原蛋白和明胶的起泡性与泡沫稳定性

综上,为拓宽大鲵皮的开发利用领域,本文研究了大鲵皮胶原蛋白的提取技术,并对其特性进行了研究。结果表明,大鲵皮胶原蛋白保留了较完整的三股螺旋结构,通过测定其吸水性、保水性、乳化性、起泡性等特性,结果均显示良好,表明其在食品、生物医药、化妆品等领域具有较大的开发价值。

基金项目:湖南省教育厅科学研究项目(21C1587);湖南省中央引导地方科技发展资金项目(2022ZYQ044)。

作者简介:周艳华(1983-),女,汉族,湖南汝城人,高级工程师,硕士研究生,研究方向为大鲵生物活性物质。

*通信作者:罗庆华(1970-),女,白族,湖南耒阳人,教授,研究方向为大鲵精深加工技术。

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