发酵乳和乳饮料中乳酸菌活菌数ATP检测方法的开发与应用

摘 要：乳酸菌活菌数作为发酵乳和乳酸菌饮料的产品质量属性，同时作为国家风险抽检项目，目前的检测方法存在操作烦琐、检测周期长、结果滞后等缺点，无法满足企业产品卖点宣称及质量控制，故针对发酵乳和乳饮料中乳酸菌活菌数的快速检测方法进行开发、研究，旨在提高检测结果准确性、稳定性及缩短检测周期。每种微生物中的腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）含量都是基本恒定的，而ATP的相对发光单位（Relative Luminescence Unit，RLU）与ATP含量呈线性关系，通过建立产品中乳酸菌数量与ATP的RLU（相对发光单位）的相关关系开发乳酸菌快速检测方法。通过试验证实该方法与国家标准检测方法具有一致性，能够快速、准确地检测产品中乳酸菌数活菌数，为生产销售流通中的质量监测提供一种快捷方便的方法。

关键词：乳酸菌总数；腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）；发酵乳；发酵乳饮料；快速检测

Development and Application of ATP Detection Method for Lactobacillus Viable Count in Fermented Milk and Milk Beverage

WANG Hui1， WEI Liming2， LIU Chao2， YU Dongwei3， LU Gang3*

（1.Mengniu Hi-Tech Dairy Products （Beijing） Co.， Ltd.， Beijing 101100， China; 2.Mengniu Dairy （Tianjin） Co.， Ltd.， Tianjin 301700， China; 3.Inner Mongolia Mengniu Dairy （Group） Co.， Ltd.， Hohhot 011500， China）

Abstract： As the product quality attribute of fermented milk and lactic acid bacteria beverage， and as a national risk sampling project， the current detection method has the shortcomings of cumbersome operation， long detection cycle and lagging results， which cannot meet the selling point claim and quality control of enterprises， so the rapid detection method for the number of live lactic acid bacteria in fermented milk and milk beverage is developed and studied， aiming to improve the accuracy， stability and shortening of the detection cycle. The research data showed that the ATP content in each microorganism was basically constant， and the RLU （relative luminescence unit） of ATP was linearly related to the ATP content. Develop a rapid detection method for lactic acid bacteria by establishing a correlation between the number of lactic acid bacteria in the product and the relative luminescence unit （RLU） of ATP. The test proves that the method is consistent with the national standard detection method， which can quickly and accurately detect the number of lactic acid bacteria and the number of viable bacteria in the product， and provide a fast and convenient method for quality monitoring.

Keywords： total number of lactic acid bacteria; adenosine triphosphate（ATP）; fermented milk; fermented milk drink; quick detection

目前，发酵乳及乳饮料中乳酸菌活菌数的检测均依据食品安全国家标准方法开展，该类方法检测过程烦琐、检测周期较长、关键指标结果出具时间滞后，对生产过程质量控制带来极大的不便，同时检测结果受人员操作、培养时间、培养温度等因素的影响较多，结果准确性和稳定性差。为降低上述缺陷带来的质量风险，需要建立一种快速检测乳酸菌活菌数的方法并应用于产品质量控制[1]。

本研究引入腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）检测系统，通过测定样品中的ATP浓度，即可推算出活菌数。随着ATP浓度的增加，相对发光单位（Relative Luminescence Unit，RLU）越来越高，ATP浓度与RLU存在线性关系[2]。该方法操作简单、结果准确、检测周期短，单个样品检测仅需10 min。ATP生物发光法有望发展为方便、快速、经济的微生物检测方法，在食品工业上将展示出广泛的应用前景。

1 材料与方法

1.1 样品、仪器与试剂

1.1.1 样品

蒙牛优益C乳酸菌饮料、蒙牛冠益乳、大果粒发酵乳，以及蒙牛杯酸发酵乳。

1.1.2 仪器

EPIC荧光仪（LUM-EPIC）；恒温培养箱：（36±1）℃；天平：感量0.01 g。

1.1.3 试剂

仪器配套的检测试剂、日常清洗试剂盒（EPIC-CLEAN）、日常监控试剂盒（EPIC-CTRL）、96孔微孔板（EPIC-MP-96-50）、无菌生理盐水。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

无菌生理盐水（0.85%）：称取氯化钠8.5 g加入1 000 mL的蒸馏水中，加热溶解，分装后121 ℃高压灭菌15～20 min。

1.2.2 样品制备

取产品将其充分摇匀后，无菌操作称取样品25 g放入装有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶中，充分振摇，制成1∶10的样品匀液。吸取10倍样品稀释液50 μL转移至微孔中。

1.2.3 样品检测

产品经过前处理后，置于无菌容器中混匀，移取50 μL样品到微孔板微孔中。使用EPIC荧光仪检测。

1.2.4 结果计算

所有待测样品孔检测完成后，输出PDF版本样品RLU值结果，各样品依据阈值进行判定即可。

2 结果与分析

2.1 ATP检测方法在发酵乳中的应用

2.1.1 ATP信号值与乳酸菌浓度的相关性分析

为了确定ATP荧光信号强度与发酵乳中乳酸菌含量的关系，根据微生物的生长规律，选择0 h、

24 h和48 h的样品数据进行相关性分析，标准曲线、线性方程、相关系数见图1、图2、图3。由图1、图2、图3可知，产品生产后0 h、24 h、48 h，所有样品的ATP信号值（RLU）与乳酸菌总数均有良好的相关性，其R2均＞0.99。

2.1.2 发酵乳阈值的设定

使用发酵乳样品上机检测，选择10批次发酵乳产品，依据1.2的步骤处理后上机检测，每个样品重复检测8次，根据检测结果设定阈值。由表1可知，所有样品的RLU值范围为294～3 480，大于294的样品乳酸菌数都大于1.0×107 cfu·g-1，《食品安全国家标准 发酵乳》（GB 19302—2010）要求为≥1.0×106 cfu·g-1，能够满足国家标准要求，故可以采用荧光值大于294作为放行标准，但是需要结合工厂实际品项及风险考虑（实际产品活菌数多处于108～109 cfu·g-1），应加严快检方法的阈值设定，即采用较高的ATP（RLU）为放行标准，这样既满足国家标准要求，也能在满足高效检测的基础上降低产品不合格放行风险，所以对于发酵乳制品根据目前数据可以ATP（RLU）值大于3 000 RLU为放行标准。

2.1.3 发酵乳ATP测定法与国家标准方法结果比对

以发酵乳产品为试验对象，通过两种方法测定乳酸菌活菌数试验结果见表2。说明ATP检测方法与国家标准检测方法在结果判定上具有一致性。

2.2 ATP检测方法在乳酸菌饮料中的应用

2.2.1 ATP信号值与乳酸菌浓度的相关性分析

为了确定ATP荧光信号强度与乳酸菌饮料中乳酸菌含量的关系，根据微生物的生长规律选择0 h、24 h和48 h的样品的数据进行相关性分析，结果见图4、图5和图6。所有样品的ATP信号值（RLU）与乳酸菌总数均有良好的相关性，其R2均＞0.99。

2.2.2 乳酸菌饮料阈值的设定

使用乳酸菌饮料样品上机检测，选择10批次乳酸菌饮料产品，依据1.2步骤处理后上机检测，根据检测结果设定阈值。由表3可见，20种RLU值的范围为8 918～20 345，大于8 918 RLU的样品乳酸菌数都大于7.6×108 cfu·g-1，目前依据《食品安全国家标准 发酵乳》（GB 19302—2010）要求为≥1.0×106 cfu·g-1，能够满足国家标准要求，可以采用荧光值大于8 918 RLU作为放行标准，考虑实际产品活菌数多处于108～109 cfu·g-1范围（其10倍生理盐水稀释液荧光值处于10 000以上），故可以加严快检方法的阈值设定，采用较高的ATP（RLU）为放行标准，在满足高效检测的基础上降低产品不合格放行风险，所以对于乳酸菌饮料产品根据目前数据可以ATP（RLU）值大于8 000 RLU为放行标准[3]。

表3可以看出，最低值8 918时产品乳酸菌数已达到108 cfu·g-1，满足蒙牛乳制品（天津）有限责任公司的质量要求及产品宣称，故定8 000即可[4]。

2.2.3 乳酸菌饮料ATP测定法与国家标准方法结果比对

以乳酸菌饮料产品为试验对象，根据两种方法测定乳酸菌活菌数试验结果见表4。说明ATP检测方法与国家标准检测方法在结果判定上具备一致性。

2.3 影响因素分析

2.3.1 检测时间对乳酸菌数的影响分析

将发酵乳、乳酸菌饮料按类型各自抽取3批产品分别在0 h、24 h、48 h进行检测，分析检测时间对乳酸菌数的影响，结果见表5。0 h与24 h的乳酸菌数t值（t=0.294＜t0.05，2=4.303），24 h与48 h的乳酸菌数t值（t=0.825＜t0.05，2=4.303），0 h与48 h的乳酸菌数t值（t=0.313＜t0.05，2=4.303），两两之间的t值均小于t0.05，2，说明不同检测时间下乳酸菌数之间无显著差异。由此证明检测时间对乳酸菌总数无明显影响，48 h内检测均能保证结果的准确性[5-6]。