高效液相色谱法测定莱芜鸡腿葱不同食用部位中维生素C含量的方法优化

摘 要：本文采用高效液相色谱法测定莱芜鸡腿葱葱茎及葱叶中的维生素C（L-抗坏血酸）含量，并进行了方法优化研究。样品采用1.0%的草酸溶液作为提取液超声提取2次，经Kromasil C18柱分离后，用紫外检测器在254 nm波长处检测，以保留时间定性，外标法定量。结果显示，维生素C质量浓度在2.0～100.0 mg·L-1时的线性关系较好（R=0.999 5），精密度试验的相对标准偏差为1.33%（n=6），加标回收率为94.9%～96.1%，方法检出限为2.0×10-3 g·kg-1。该测试方法简便快速，能准确测定莱芜鸡腿葱葱茎及葱叶中维生素C含量。

关键词：高效液相色谱法；莱芜鸡腿葱；葱茎；葱叶；维生素C

Optimization of High Performance Liquid Chromatography Method for Determining Vitamin C Content in Different Edible Parts of Laiwu Jitui Onion

CAO Feng1， GAO Feng1， WANG Yanhong2， GENG Dongqing1

（1. Jinan Food and Drug Inspection and Testing Center， Jinan 250102， China;

2. Laiwu District Comprehensive Inspection and Testing Center， Jinan 271100， China）

Abstract： In this paper， high performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine the vitamin C （L-ascorbic acid） content in the onion stems and leaves of Laiwu Jitui onions， and the method was optimized. The samples were extracted twice with 1.0% oxalic acid solution as the extracting solution by ultrasonic extraction， separated on a Kromasil C18 column， and detected by an ultraviolet detector at 254 nm. The samples were qualitatively analyzed by the retention time， and quantitatively analyzed by the external standard method. The results showed that there was a good linear relationship （R=0.999 5） when the mass concentration of vitamin C was between 2.0 mg·L-1 and 100.0 mg·L-1. The relative standard deviation of the precision test was 1.33% （n=6）， the recovery rate was 94.9%～96.1%， and the detection limit of the method was 2.0×10-3 g·kg-1. This testing method is simple and fast， and can accurately determine the vitamin C content in the stems and leaves of Laiwu Jitui onion.

Keywords： high performance liquid chromatography; Laiwu Jitui onion; onion stem; onion leave; vitamin C

莱芜鸡腿葱是著名的“莱芜三辣”之一，已有2 000多年的栽培历史，是品质优良的山东地方特色蔬菜，2013年获得了原农业部“农产品地理标志”原产地认证。莱芜鸡腿葱葱白质地细脆，辛辣味浓，适宜熟食，其营养比较丰富，含有氨基酸、无机盐、蛋白质等多种营养物质，富含杀菌能力极强的大蒜素和维生素A、维生素C等活性成分[1-2]。维生素C又叫L-抗坏血酸，是一种水溶性维生素，有较强的抗氧化作用，是人体维持正常代谢不可缺少的一类营养物质，具有提高人体免疫力，预防动脉硬化等功效，严重缺乏维生素C会引起坏血病[3-4]。

葱叶中维生素C含量要高于葱茎[5]，但葱叶却常作为废弃物丢弃，从资源利用及环境角度来说容易造成浪费和污染，因此准确测定葱茎及葱叶中的维生素C含量对于其充分利用具有重要意义。维生素C的常用检测方法有2，6–二氯靛酚钠盐滴定法、高效液相色谱法、紫外分光光度法等[6-7]，其中高效液相色谱法是目前最常用的检测方法，具有操作简单、快速灵敏、重现性好等特点[8-9]。

为充分提取莱芜鸡腿葱不同食用部位中的维生素C，并防止其在测试过程中氧化分解，本文参照相关研究[6，10-11]并加以优化，以1.0%的草酸溶液替代国家标准GB 5009.86—2016[12]中使用的有剧毒的偏磷酸溶液作为提取液，超声提取两次，以提高维生素C的提取率，在此基础上对高效液相色谱仪相关参数进行优化，旨在为合理利用莱芜鸡腿葱提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

莱芜鸡腿葱购于济南市莱芜区牛泉镇鸡腿葱种植专业合作社。维生素C标准品（L-抗坏血酸），默克股份两合公司；甲醇（色谱纯），天津市康科德科技有限公司；草酸（优级纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；检验用水为自制纯净水。

LC-20A高效液相色谱仪（紫外检测器），日本岛津公司；UV-8000A双光束紫外可见分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司；JM-38D-45超声波清洗机，深圳市洁盟清洗设备有限公司；2-16KL高速冷冻离心机，德国SIGMA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相：甲醇-0.1%草酸溶液（5∶95，V∶V）；流速：1 mL·min-1；进样量：20 μL；色谱柱柱温：25 ℃；检测波长：254 nm。以保留时间定性，外标法定量[11]。

1.2.2 样品处理

称取切碎的葱茎及葱叶样品各10 g（精确至0.001 g）置于研钵中，加入1.0%的草酸溶液10 mL，迅速研磨成浆，转移至容量为50 mL的离心管中，再用少量1.0%的草酸溶液冲洗研钵2次，涡旋混匀，放入超声波振荡器中低温超声提取（功率为100 W，水温4 ℃左右）20 min，在高速冷冻离心机中离心10 min（4 ℃，6 000 r·min-1），将全部上清液转移到25 mL棕色容量瓶中，冰箱中冷藏。研钵中再加入10 mL 1.0%的草酸溶液，涡旋混匀后重复上述步骤，将两次提取液合并后用1.0%的草酸溶液定容并混匀，用孔径为0.45 μm的水相滤膜过滤后冷藏。

1.2.3 标准溶液的配制

称取维生素C标准品10.0 mg（精确至0.1 mg），用纯水定容至10 mL，配制成1 000 mg·L-1的中间液；再用纯水将标准中间液逐级稀释成浓度为2.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、40.0 mg·L-1、60.0 mg·L-1、80.0 mg·L-1及100.0 mg·L-1的维生素C标准工作液，4 ℃避光保存。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测器波长的确定

利用紫外分光光度计对浓度为40 mg·L-1的维生素C标准物质溶液进行全波长扫描，结果显示维生素C在波长254 nm处有最大吸收，为减少测试时杂质干扰，提高仪器的稳定性，测试波长确定为254 nm。

2.1.2 流动相组分的选择

维生素C有较强的还原性[13]，通常条件下较容易氧化，但是在弱酸性条件下能够保持稳定[14]。为保证维生素C在测试过程中的稳定性，需要选择酸性流动相，考虑到较强酸性的流动相可能会对液相系统产生较大的腐蚀性[15]，而国家标准中流动相使用的离子对试剂会对色谱柱产生不可逆的损害，参考相关文献资料[7-9，16]，本研究选用甲醇-0.1%草酸溶液作为流动相。

参照相关研究[8，11，13，16]，研究甲醇与0.1%草酸溶液的体积比为5∶95、10∶90及20∶80时对检测结果的影响。结果发现，流动相的体积比为5∶95时目标物保留时间为2 min左右，且目标峰与干扰峰有较好的分离；当流动相体积比为10∶90及20∶80时，维生素C的保留时间变短，其色谱峰与干扰峰无法完全分离。考虑到定量精度，本文选择甲醇与0.1%草酸溶液体积比为5∶95。

2.1.3 柱温的确定

色谱柱温度升高，柱内压力变小，维生素C的保留时间变短，会影响色谱柱的分离效果[16]。由于维生素C在高温下不稳定，本研究选择柱温为25 ℃。

根据上述确定的测试条件，维生素C标准物质的色谱图如图1所示，莱芜鸡腿葱葱茎及葱叶色谱图见图2、图3。

2.2 维生素C的线性和检出限

按1.2.3项方法配制标准系列溶液，以维生素C质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。由图4可知，标准曲线回归方程为Y=49 331X+10 072，在2.0～100.0 mg·L-1维生素C浓度及峰面积线性关系良好，相关系数R=0.999 5。按照3倍信噪比确定方法检出限为2.0×10-3 g·kg-1。

2.3 精密度实验

准确称取鸡腿葱葱叶样品按照1.2.2项方法处理，在1.2.1项色谱条件下对样品分别测定6次，测定结果见表1。可以看出，精密度实验的RSD为1.33%，表明该测试方法的精密度较好。

2.4 加标回收实验

以鸡腿葱葱叶为实验样品，在校正曲线的线性范围内，按照表2中的添加量进行加标回收实验，结果见表2。可以看出，样品加标回收率在94.9%～96.1%，RSD为0.67%，表明测定结果准确可靠。

2.5 样品测定

按本文实验方法对莱芜鸡腿葱样品的葱茎和葱叶进行了检测，葱茎中维生素C含量为5.6 mg/100 g，葱叶中维生素C的含量为11.1 mg/100 g（表1），葱叶中维生素C的含量远高于葱茎，是葱茎含量的1.98倍。

3 结论

莱芜鸡腿葱葱茎、葱叶中的维生素C采用1.0%的草酸溶液超声提取后，以体积比为5∶95的甲醇-0.1%草酸溶液为流动相，利用紫外检测器在波长为254 nm的条件下检测，一次进样，可以在3 min内完成对莱芜鸡腿葱中维生素C的分析。在质量浓度为2.0～100.0 mg·L-1时，维生素C的校准曲线线性关系较好，R=0.999 5，精密度试验的平均RSD为1.33%（n=6），方法的加标回收率为94.9%～96.1%，检出限为2.0×10-3 g·kg-1。本方法分离效果好、简单高效，可用于莱芜鸡腿葱葱茎与葱叶中维生素C含量的测定。