石墨消解-全自动凯氏定氮法测定液体乳中的蛋白质及其方法验证

摘 要：采用石墨消解仪消解，全自动凯氏定氮仪蒸馏滴定，建立液体乳中蛋白质含量的测定方法。结果表明，蒸馏时样品取1.0～2.5 g、硫酸取5 mL、硫酸铜和硫酸钾用量分别为0.1 g和1.5 g，消解滴定时加碱量为25 mL、硼酸10 mL、稀释水20 mL、蒸馏时间5 min，该条件下检测效果最佳。选择10种代表性液体乳进行方法验证，所得结果均符合国家标准要求。与传统凯氏定氮法相比，该方法操作简单、安全、高效，适用于液体乳蛋白质的日常检测。

关键词：石墨消解仪；全自动凯氏定氮仪；蒸馏；滴定

Determination of Protein in Liquid Emulsion by Graphite Digestion-Kjeldahl Nitrogen Analyzer and Verification of the Method

HAO Qin

（Miluo City Food and Drug Inspection Institute， Yueyang 414400， China）

Abstract： A method for determining protein content in liquid milk was established by using a graphite digestion instrument for digestion and a fully automatic Kjeldahl nitrogen analyzer for distillation and titration. The results showed that during distillation， the sample volume was taken as 1.0～2.5 g， sulfuric acid was taken as 5 mL， copper sulfate and potassium sulfate were used as 0.1 g and 1.5 g， respectively. During digestion titration， 25 mL of alkali was added， 10 mL of boric acid was added， 20 mL of diluted water was added， and distillation time was 5 minutes. Under these conditions， the best effect was achieved. Ten representative liquid emulsions were selected for the validation of this method， and the results obtained all met the requirements of national standards. Compared with the traditional Kjeldahl method， this method is simple， safe， and efficient， and is suitable for daily detection of liquid milk proteins.

Keywords： graphite digester; automatic kjeldahl nitrogen analyzer; distillation; titration

蛋白质是液体乳检测中常用且重要的质量指标[1-2]。国家标准中关于蛋白质的检测方法虽然很全面，但考虑到传统的凯氏定氮法检测速度慢，蒸馏装置安全性不够，且对于仪器的具体操作说明不够详细，为提高检测效率，本文针对石墨消解-全自动凯氏定氮法进行优化。优化后的方法不仅操作简单、安全、高效，能同时处理多个样品，且准确率较高，适用于液体乳中蛋白质的日常检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大白兔奶糖风味牛奶，北京光明健能乳业有限公司；伊利纯牛奶，宁夏伊利乳业有限责任公司；安慕希希腊风味酸奶，宁夏伊利乳业有限责任公司；燕麦牛奶，济源伊利乳业有限责任公司；三元纯牛奶（全脂灭菌乳），新乡市三元食品有限公司；旺仔牛奶（调制乳），湖南大旺食品有限公司；特仑苏纯牛奶，蒙牛特仑苏（银川）乳业有限公司；蒙牛纯牛奶，内蒙古蒙牛圣牧高科奶业有限公司；QQ星儿童成长牛奶，潍坊伊利乳业有限责任公司；新希望纯牛奶，湖南新希望南山液态乳业有限公司。

硫酸铜（CuSO4·5H2O）、硫酸钾（K2SO4）、硫酸（H2SO4）、硼酸（H3BO3）、溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S）、甲基红指示剂（C15H15N3O2）、氢氧化钠（NaOH）、95%乙醇（C2H5OH），分析纯；0.050 0 mol·L-1盐酸标准滴定溶液；0.100 0 mol·L-1盐酸标准滴定溶液；0.050 0 mol·L-1硫酸铵标准溶液；实验用水为GB/T 6682—2008规定的三级水。

1.2 仪器与设备

CP214电子天平（感量为1 mg）：奥豪斯仪器（上海）有限公司；K9860全自动凯氏定氮仪：山东海能科学仪器有限公司；SH220N石墨消解仪：山东海能科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的消解

称取混合均匀的液体乳1.0～2.5 g，移入洁净干燥的100 mL消化管中，加入0.1 g硫酸铜、1.5 g硫酸钾和5 mL硫酸，按照表1设定的石墨消解程序进行消解。

1.3.2 测定方法

消解完成后，将消化管取出冷却，再将其安装在全自动凯氏定氮仪上，仪器自动加液、蒸馏和滴定，记录滴定体积V1。同时做试剂空白。试样中蛋白质含量按公式（1）计算。

式中：X为试样中蛋白质的含量，g/100 g；V1为试液消耗盐酸标准滴定液的体积，mL；V2为试剂空白消耗盐酸标准滴定液的体积，mL；C为盐酸标准滴定溶液浓度，mol·L-1；m为试样的质量，g。

1.4 数据分析

蛋白质含量≥1 g/100 g时，结果保留3位有效数字；蛋白质含量＜1 g/100 g时，结果保留两位有效数字。

2 结果与分析

2.1 消解条件分析

2.1.1 样品称样量的优化

GB 5009.5—2016[3]中自动凯氏定氮法要求液体试样的称取量为10～25 g，但用石墨消解仪消解时容易引起爆沸以及消解不完全，而且消解需要的催化剂以及浓硫酸用量较多，耗时较长，消解后的样液不稀释直接上机，容易导致后续碱化蒸馏所需要的氢氧化钠成倍增加，而消化管容量有限（一般为100 mL），且液体乳属于均匀度较好的样品，故本方法参照国标凯氏定氮法将液体乳的称样量在蒸馏前稀释10倍，最终选定为1.0～2.5 g（预实验结果）。

2.1.2 硫酸用量的确定

硫酸在消解过程中的主要作用是将样品碳化，然后与分离出的氮元素反应，转化为硫酸铵[4]。由此可见，硫酸用量与样品中的含氮量密不可分。国家标准中称取10～25 g样品，硫酸用量为20 mL，比对参照，样品量为1.0～2.5 g时，硫酸用量应为2 mL，但考虑到样品消解最长达2.5 h，会有烧干风险，故将硫酸用量选为5 mL。

2.1.3 催化剂用量的选择

硫酸铜和硫酸钾作为催化剂与硫酸协同作用，加速蛋白质的消解，其使用量与硫酸用量密切相关。硫酸钾能够提高硫酸沸点，从而加快样品分解；硫酸铜能加速样品的氧化分解，也是样品消化完全的指示剂（蓝绿色、澄清、透明），还能在蒸馏时作为碱性反应的指示剂[5]（变深蓝色或产生黑色沉淀）。国家标准中20 mL硫酸与0.4 g硫酸铜和6 g硫酸钾协同作用，本实验将硫酸用量定为5 mL，将硫酸铜、硫酸钾用量分别调整为0.1 g、1.5 g。

2.2 蒸馏滴定条件

2.2.1 加碱量的确定

蒸馏过程中加入碱液是为了中和消解时剩余的硫酸，同时造成碱性环境，与氮反应生成氨气，使其游离出来，加碱量与硫酸和样品中的含氮量息息相关。凯氏定氮法中液体试样10～25 g（相当于30～40 mg氮）、20 mL硫酸消解，蒸馏时从100 mL处理液中吸取2.0～10.0 mL（稀释10～50倍），此时硫酸剩余量不超过2 mL，含氮量不超过4 mg，碱化过程采用10 mL氢氧化钠溶液（400 g·L-1）。本方法消解时取1.0～2.5 g液体乳（相当于3～4 mg氮）、5 mL硫酸，蒸馏滴定时不稀释，用碱量[氢氧化钠溶液（400 g·L-1）]不得低于25 mL。

2.2.2 蒸馏时间的确定

为确定最佳蒸馏效果，用0.050 0 mol·L-1硫酸铵标准溶液进行测试，消化管不少于5支，每支消化管内移取硫酸铵溶液10 mL，将其安装在全自动凯氏定氮仪上，设置参数：样品重量输入0.014 g，采用0.100 0 mol·L-1盐酸标准滴定溶液，空白体积0.10 mL，蛋白系数0，硼酸20 mL，稀释水20 mL，碱液10 mL，蒸馏时间分别设置为4 min、5 min、6 min、8 min、10 min，分别测得其滴定结果V，并计算回收率（）。结果表明，蒸馏时间为5 min和6 min时，回收率符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）的要求。但考虑时间成本，最终确定蒸馏时间为5 min。

2.2.3 硼酸用量的确定

硼酸主要用来吸收游离出来的氨，生成硼酸铵，其用量与样品中的含氮量有直接关系。凯氏定氮法中参与蒸馏的样品中的含氮量不超过4 mg，此时的硼酸用量为10 mL，本方法用于蒸馏的样品中的含氮量也没超过4 mg，所以硼酸用量也选定为10 mL。

2.2.4 稀释水用量的确定

加入适量的水是为了缓解浓硫酸浓碱的反应程度，《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）中自动凯氏定氮仪取20 mL浓硫酸消解后加50 mL水稀释再上机继续蒸馏滴定，本方法消解时的硫酸用量为5 mL，对比参照下最终选用20 mL稀释水进行实验。

2.3 方法验证

本文选取了10种不同生产厂家的液体乳（见1.1），从1～10进行编号，分别用本文实验方法和GB 5009.5—2016中5.1凯氏定氮法对样品中蛋白质含量进行检测，每个样品平行2次，检测结果如表2所示。《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）中精密度要求在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%（即相对差值不得超过10%）。该实验中两种方法的平行实验均满足该要求。将标准方法所得结果看作真值，用本文实验方法对同一批样品分别进行测定，发现两组数据也都满足精密度要求。由此表明，本方法实验结果准确、可靠。

3 结论

本文优化了消解、蒸馏和滴定参数，并用石墨消解仪-全自动凯氏定氮仪测定了市售的10种液体乳中蛋白质的含量，并对其进行方法验证。结果发现本文实验方法不仅操作简单、安全、高效，能同时处理多个样品，而且准确、可靠，适用于液体乳中蛋白质的日常检测。

参考文献

[1]岳超，赵超群，毛思浩，等.通过式固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定液体乳中10种氨基甲酸酯类农药残留[J].色谱，2023，41（9）：807-813.

[2]李鹤林，周小玲，吴晓娟，等.多酚调控蛋白、多糖及蛋白-多糖复合物乳液中脂质-蛋白质共氧化研究进展[J/OL].食品科学，1-15[2023-11-12].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20231020.1535.010.html.

[3]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定：GB 5009.5—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[4]于晓菲，赵丽芳，商姗姗，等.石墨消解仪-定氮仪法测定有机肥料中总氮[J].磷肥与复肥，2023，38（3）：32-34.

[5]刘宗超，蔡兴，文田耀，等.石墨消解仪–凯氏定氮法测定土壤中全氮量[J].化学分析计量，2022，31（12）：55-58.