一测多评法测定茶饮料中咖啡因、茶多酚总量及其5种主要组分的含量

摘 要：目的：建立茶饮料中咖啡因、茶多酚总量、儿茶素、没食子酸、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素的一测多评法。方法：采用HPLC法，以咖啡因为内参物，计算茶多酚总量，其余5种多酚物质的相对校正因子，并考察相对校正因子的稳定性，比较外标法和一测多评法对茶饮料中7个指标的测定结果。结果：6种被测物质的相对校正因子分别为儿茶素0.34、没食子酸1.41、表儿茶素0.86、表没食子儿茶素没食子酸酯0.80、表没食子儿茶素1.53、茶多酚总量133.91。相对校正因子在不同含量样品下的RSD为2.95%～8.78%，均小于10%，稳定性良好。一测多评法和外标法所得茶饮料中7个指标的含量在统计学上无明显差异。结论：建立的一测多评法准确、可靠，可为茶饮料的质量控制提供参考。

关键词：茶饮料；色谱法；一测多评；茶多酚；咖啡因

Determination of Caffeine， Total Amount of Tea Polyphenols and Their Five Main Components in Tea Beverages by Using a One Test Multiple Evaluation Method

LI Yuhong， CHEN Jia*， WEI Zhichao， YU Zheyuan

（Zhangye Quality Inspection and Testing Institute， Zhangye 734000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of caffeine， total amount of tea polyphenols， catechin， gallic acid， epicatechin， epicatechin gallate and epicatechin in tea beverages. Method： HPLC was used to calculate the total amount of tea polyphenols and the relative correction factors of other 5 polyphenols， and to investigate the stability of the relative correction factors. The results of 7 indexes in tea beverage were compared between external standard method and one test and multiple evaluation method. Result： The relative correction factors of the 6 tested substances were catechin 0.34， gallic acid 1.41， epicatechin 0.86， epicatechin gallate 0.80， epicatechin 1.53， and total tea polyphenols 133.91， respectively. RSD of relative correction factors in different samples ranged from 2.95% to 8.78%， all of which were less than 10%， indicating good stability. There was no significant difference in the contents of 7 indexes in tea beverages obtained by one test and multiple evaluation method and external standard method. Conclusion： The established method is accurate and reliable， and can provide reference for the quality control of tea beverage.

Keywords： tea beverage; chromatography; one test with multiple evaluations; tea polyphenols; caffeine

茶文化在我国拥有悠久的历史和丰富的内涵，作为世界上最大的茶叶生产国，我国茶资源十分丰富。随着社会的发展和人们生活水平的提高，茶文化也得到了长足的发展。茶饮料在继承我国传统饮茶文化的前提下，作为一种饮用便捷，同时兼具传统茶叶提神解渴功效的饮品，越来越受到消费者的青睐。茶饮料一般是指采用茶叶的浓缩液、萃取液、茶粉为主要原料加工而成的饮料，具有茶叶的独特风味，其含有的茶多酚是重要的生理活性物质，有抗氧化、抗癌、降低血糖血压、防治心血管疾病以及抗衰老等多种保健功能[1-4]。根据《茶饮料》（GB/T 21733—2008）的规定[5]，茶饮料按产品风味分为调味茶饮料、茶饮料（茶汤）、复（混）合茶饮料及茶浓缩液4类，目前市场上主要以调味茶饮料为主。该标准对不同茶饮料中茶多酚类物质总量以及咖啡因含量进行了明确的规定。

茶多酚为混合物[6-7]，最主要的成分是多酚类化合物，还含有儿茶素、没食子酸、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素等多酚类物质。GB/T 21733—2008标准规定，茶多酚的测定采用分光光度法[5]。虽然该方法可以根据多酚类物质与亚铁离子的特异性显色反应对茶多酚进行定量，但过程较为烦琐，实验人员的操作方式、显色时间和显色条件等对实验结果可能产生明显影响，为大量样品的检验带来不便。本文采用液相色谱法，实现了对咖啡因、茶多酚中主要组分儿茶素、没食子酸、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素的定量分析，并找到了其与茶多酚总量间的定量关系，有效避免了紫外分光光度法带来的试剂用量大、系统误差大的弊端，提高了准确度和检验效率。

茶饮料中主要生物活性成分为咖啡因和茶多酚，在国标GB/T 21733—2008中也将这两种主要成分作为质量控制指标，咖啡因和茶多酚均是由茶叶天然代谢生成的物质，所以可以预见，上述成分间存在相关性。一测多评法（QAMS法）[8]是利用天然样品不同成分内在含量关系和比例关系，通过只测定一个或几个成分，实现对相关的其他多个成分的同步测定。因此，为了提高茶饮料中茶多酚的分析效率，同时兼顾检验成本，本研究尝试采用一测多评法，通过对茶饮料中茶多酚总量，咖啡因及茶多酚主要组分儿茶素、没食子酸、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素进行定量分析，找到茶饮料中咖啡因与茶多酚总量、儿茶素、没食子酸、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素之间存在的关系，从而得到相对校正因子，旨在以咖啡因为标准物，建立茶多酚总量、儿茶素、没食子酸、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素的一测多评法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

现制现售绿茶饮料，购买于本地市场。

没食子酸标准品、儿茶素标准品、咖啡因标准品、表儿茶素标准品、表没食子儿茶素没食子酸酯标准品和表没食子儿茶素标准品，纯度均≥98%，阿拉丁试剂有限公司；福林酚试剂（分析纯），上海国药集团；甲醇（色谱纯），上海麦克林；甲酸（色谱纯），上海国药集团；无水乙醇（分析纯），上海国药集团；实验用水为密理博纯水系统（美国）制得的超纯水。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱（LC-20AD，配备二极管阵列检测器与Labsolution工作站），日本岛津；分析电子天平（赛多利斯GL323-1SCN），奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；超声波清洗机（HN-30AL），上海汉诺；紫外-可见分光光度计（I9），海能未来技术集团股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 茶多酚总量的测定

（1）样品制备。样品按GB/T 21733—2008附录A 3.1.2进行制备。称取25 g样品于50 mL离心管中，加入15 mL 95%乙醇，涡旋混匀。静置15 min后，转移至50 mL容量瓶并加水定容至刻度线，滤纸过滤后备用。

（2）茶多酚含量测定。按GB/T 21733—2008附录A 3.2进行测定。在540 nm波长下分别测定试液底色的吸光度和试液显色后的吸光度。茶多酚总量的计算公式为

X=（A1-A2）×1.957×2×K×1 000/m（1）

式中：X为样品中茶多酚含量，mg·kg-1；A1为试液显色后的吸光度；A2为试液底色的吸光度；1.957为用10 mm比色皿，当吸光度等于0.50时，1 mL茶汤中的茶多酚含量相当于1.957 mg；K为稀释倍数；

m为测定时称取试液的质量，g。

1.3.2 儿茶素、没食子酸、咖啡因、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素的测定

（1）样品制备。参照康明艳等[9]的方法，称取20 g茶饮料于50 mL离心管中，加入80%乙醇稀释并定容至刻度，涡旋1 min，过0.45 μm滤膜后，作为供试品溶液待用。

（2）标准溶液的配制。精密称取儿茶素、没食子酸、咖啡因、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素标准品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成100 μg·mL-1的混合标准品储备溶液；分别用经过检定的合适规格移液器吸取标准品储备液50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL、600 μL、800 μL和1 000 μL于进样小瓶中，用水稀释至1 mL，制成5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、15 μg·mL-1、20 μg·mL-1、25 μg·mL-1、30 μg·mL-1、60 μg·mL-1、80 μg·mL-1和100 μg·mL-1的上述组分混合标准品工作溶液。

1.3.3 HPLC二极管阵列色谱条件

检测波长：280 nm；液相色谱柱：安捷伦-USHKB03750-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；流动相：甲醇∶乙腈∶冰醋酸∶水=230∶60∶2∶708；流速：1.0 mL·min-1；分析时间：18 min。

1.3.4 校正因子的确定

相对校正因子的确定借鉴了王敏等[10]的方法，根据茶饮料的成分进行进一步优化以适用本次研究。按照1.3.2～1.3.3外标法定量得到咖啡因、儿茶素、没食子酸、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素的浓度；1.3.1紫外法得到茶多酚总量的浓度。以咖啡因（纯度≥98%）为标准物（s），建立儿茶素、没食子酸、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素和茶多酚总量的相对校正因子（Relative Correlation Factor，RCF）。相对校正因子的计算公式为

RCF=Ci/Cs（2）

式中：Ci为相应的多酚物质的浓度，μg·mL-1；Cs为标准物的浓度，μg·mL-1。

在确定保留时间稳定的基础上，采用绝对含量法，计算待测成分与标准物的绝对含量比值，并以此作为确定校正因子的依据。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 流动相的选择

利用HPLC分析测定时，不仅要考虑儿茶素、没食子酸和咖啡因之间的分离情况，还要考虑样品中其他成分对待测组分的干扰，因此在色谱条件下，应选择合适的流动相，使咖啡因、儿茶素、没食子酸、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素在合理的时间内与样品中其他组分完全分离[11]。实验中流动相的选择参照《茶饮料和调味茶饮料中咖啡因和5种儿茶素类（儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素）含量的测定 高效液相色谱方法》（DB22/T 1671—2012）[12]，以甲醇-乙腈-冰醋酸-水作为流动相，这是因为表没食子儿茶素没食子酸酯在甲醇中的稳定性较差，24 h后会部分转化成其他儿茶素类化合物[13]，而乙腈可以减小表没食子儿茶素没食子酸酯的降解速度，使表没食子儿茶素没食子酸酯能够分离出来；而冰醋酸可以抑制共聚物的生成，减少样品中其他组分的干扰，进一步改善分离效果。