测试片法检测食品中大肠菌群的验证评价

作者: 陶文靖 董彬 焦凤莲 周琦 曲连海 王琦

测试片法检测食品中大肠菌群的验证评价0

摘 要:为探究大肠菌群测试片法在食品检测中的可行性,依据国际标准ISO 16140-2:2016中的性能指标验证要求,对MicroFast®大肠菌群测试片法进行包容性、排他性,以及与国家标准《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》(GB 4789.3—2016)中方法的一致性验证,采用t-检验和Bland-Altman分析方法进行一致性分析评价。16株目标菌在测试片上形成典型菌落,24株非目标菌中的23株均未在测试片上形成菌落,阿巴特图巴沙门氏菌ATCC 35640在测试片上形成非典型菌落。测试片法和GB 4789.3—2016中方法的检测结果呈正相关(R2>0.976);95%置信区间的样品比例为1∶25,满足不得高于1∶20的要求;所有食品类型的β-期望容忍区间(β-ETI)均在±0.5对数单位范围内,测试片法和GB 4789.3—2016方法具有很好的一致性。MicroFast®大肠菌群测试片法对纯菌株的包容性和排他性良好,在一致性方面符合ISO 16140-2:2016对方法等效性的要求,可作为替代方法,用于检测食品中的大肠菌群。

关键词:测试片法;大肠菌群;平板计数法

Validation of Coliform in Food by Test Tablets Method

TAO Wenjing1, DONG Bin2, JIAO Fenglian3, ZHOU Qi1, QU Lianhai1, WANG Qi3*

(1.Beijing Meizheng Bio-Tech Co., Ltd., Beijing 102200, China; 2.Beijing Guangming Jianeng Dairy Co., Ltd., Beijing 101300, China; 3.SGS-CSTC Standards Technical Services Co., Ltd., (Qingdao), Qingdao 266071, China)

Abstract: This study was aimed to evaluate the feasibility of coliform detection in food by coliform test tablets. Based on performance indicator verification requirements of international standard ISO16140-2:2016, MicroFast® coliform test tablets method was used for evaluation, including inclusivity, exclusivity, and consistency with GB 4789.3—2016 method, and t-test and Bland-Altman analysis were used for consistency analysis and evaluation. The 16 target strains all grew typical colonies on the test tablets, and 23 of the 24 non-target strains had no colonies on the test tablets. Salmonella Abatetuba ATCC 35640 formed atypical colonies on the test tablets. There was a positive correlation between the test tablets method and the national standard method (R2>0.976). The proportion of samples exceeding the 95% confidence interval of the total average value of the difference was 1∶25, which met the ratio requirement of no more than 1∶20. The β-expected tolerance interval (β-ETI) for all food types was ±0.5log10 units, the two methods were in good agreement. MicroFast® coliform count plate had good performance in terms of inclusivity and exclusivity to pure strains, met the requirements of ISO16140-2:2016 for method equivalence in terms of consistency. It can be used as an alternative method for testing coliforms in food.

Keywords: test tablets method; coliforms; plate count method

大肠菌群(Coliforms)是指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌[1]。大肠菌群是表明食品卫生状况的指示菌,已经规定了49种食品大肠菌群的限量指标[2],大肠菌群作为食品卫生管理和安全性评价的微生物检测项目越来越受到人们的重视[3]。

目前,食品中大肠菌群计数的常规方法是平板计数法,主要参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》(GB 4789.3—2016)[1]进行检验,该方法虽然是微生物检验的“金标准”,但其操作流程复杂,工作量较大且对操作人员的经验要求较高,致使检测效率不高[4]。随着国际交流合作的开展、标准的进一步互认,逐渐出现多种经过国际权威组织认证的即用型大肠菌群检测产品,如测试片等[5]。测试片主要成分包括显色剂(由显色基团和微生物代谢物组成)、培养基、冷水可凝胶等,微生物生长代谢产生的酶与显色剂中的特定代谢物反应,使显色基团显色[6]。测试片法操作简单,结果易观察,误差小。大肠菌群测试片操作简单,结果判定符合GB 4789.3—2016中对大肠菌群“产酸、产气”的定义,培养时间仅18~24 h[7],实验工作效率高。因此,测试片法在食品检测领域应用广泛。许金榜[8]采用大肠菌群4种目标菌对测试片和VRBA进行分离与选择性比较,结果表明,VRBA和测试片的检测性能均可满足大肠菌群的定量检测要求。

本研究拟采用MicroFast®大肠菌群测试片,以平板计数法[1]为参考方法,参考国际标准ISO 16140-2:2016[9]的性能指标验证要求,对测试片法进行包容性、排他性及方法一致性验证。

1 材料与方法

1.1 试剂及设备

MicroFast®大肠菌群测试片,北京美正生物科技有限公司;营养肉汤、磷酸盐缓冲液、结晶紫中性红胆盐琼脂、煌绿乳糖胆盐肉汤,北京陆桥技术股份有限公司。BAGMIXER 400均质器,法国Interscienc公司;VORTEX GENIUS3涡旋振荡器,德国IKA公司;LRH-250恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 菌株

目标菌株共16株,包括大肠埃希氏菌(Escherichia coli,CGMCC 1.0090;ATCC 25922;ATCC 8739;CICC 23657;CICC 10305;CICC 10354;ATCC 8099)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae,ATCC 4352)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes,ATCC 13048)、莫金斯克罗诺杆菌(C. muytjensii,ATCC 51239)、肠产毒性大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,CICC 10667)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(Enteroinvasive Escherichia coli,CICC 10662)、大肠埃希氏菌O157(Escherichia coli O157,CICC 10907)、肠道致病性大肠埃希氏菌(Enteropathogenic Escherichia coli,CICC 24189)、肠道出血性大肠埃希氏菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,CICC 24187)、肠道集聚性大肠埃希氏菌(Enteroag-gregative Escherichia coli,CICC 24186)。

非目标菌株共24株,包括阿巴特图巴沙门氏菌(S. abaetetuba,ATCC 35640)、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa,ATCC 9027)、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa,AS 1.1129)、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa,ATCC15442)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri,ATCC 12022)、屎肠球菌(Enterococcus faecium,ATCC 8459)、副溶血性弧菌(Vibrio para,ATCC 17802)、金黄色葡萄球菌(S. aureas,ATCC 6538)、金黄色葡萄球菌(S. aureas,ATCC 25923)、金黄色葡萄球菌(S. aureas,ATCC 6538p)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,ATCC 49619)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis,ATCC 33186)、荧光假单胞菌(P. fluoresoens,ATCC 13525)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus,CICC 6045)、伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii,CICC 21663)、英诺克李斯特氏菌(Listeria innocua,CICC 10297)、蜡样芽孢杆菌(B. cereus,ATCC 11778)、蜡样芽孢杆菌(B. cereus,CMCC 63301)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes,CICC 10373)、莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus leichmannii,ATCC 7830)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus casei spp. rhamnosus,ATCC 7469)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,ATCC 19115)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis,ATCC 11774)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis,ATCC 6633)。

1.3 食品基质

选用5大类食品类型,每个大类选择6种食品基质,包括市售乳及乳制品,冷冻饮品,水果和蔬菜,肉及肉制品,粮食和粮食制品。其中22种采取人工污染接种方式的食品基质见表1。

1.4 试验方法

1.4.1 参考方法

以《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》(GB 4789.3—2016)[1]中的平板计数法为参考方法。

1.4.2 测试片法

参照MicroFast®大肠菌群测试片说明书进行操作。打开测试片覆盖膜,将1 mL样液滴入培养基中央,慢慢盖上盖膜,待样液完全渗入培养基内,置于恒温培养箱内,(36±1)℃培养18~24 h,计数测试片上带气泡的红色菌落。

1.4.3 包容性和排他性验证

分别将目标菌和非目标菌共40株进行复苏培养后,梯度稀释成浓度为10~100 CFU·mL-1的菌液,分别取上述菌液1 mL添加到测试片上,(36±1)℃培养18~24 h,观察菌落生长情况和菌落形态。

1.4.4 方法一致性验证

(1)菌株准备。选用大肠埃希氏菌(ATCC 25922)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC 4352)和产气肠杆菌(ATCC 13048)3株阳性菌作为目标菌,复苏培养后,梯度稀释成浓度为250~2 500 CFU·mL-1、2 500~25 000 CFU·mL-1 和25 000~250 000 CFU·mL-1的低、中、高3种浓度的菌液。

(2)样本准备。食品基质选择自然污染样品和人工添加样品,每个食品类型的基质包括低、中、高3种污染水平,每种食品基质做5个重复测试。因为食品基质含有背景菌,所以只添加目标阳性菌。每个样品称取5份,每份25 g,分别加入1 mL 1.4.4(1)中对应浓度的目标菌,使得每份样品中目标菌的含量为低浓度10~100 CFU·g-1、中浓度100~1 000 CFU·g-1、高浓度1 000~10 000 CFU·g-1。

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