基于酶底物法检测饮用水中大肠埃希氏菌的研究

作者简介：张莹（1990—），女，北京人，本科，主管检验师。研究方向：微生物检验。

摘 要：为探究酶底物法检测饮用水中大肠埃希氏菌的准确性和便捷性，从不同地点采集水样，采用标准检测法和酶底物法同时检测饮用水中的大肠埃希氏菌。结果表明，标准检测法检测出16份阳性样品和

3份阴性样品，酶底物法检测出17份阳性样品和2份阴性样品，两种方法检测的阳性率无显著性差异（P＞0.05）；14份样品最大可能数一致，5份样品最大可能数有差异，酶底物法检测的灵敏度高于标准检测法。本研究为饮用水中微生物的快速、高效检测提供了数据基础。

关键词：大肠埃希氏菌；饮用水；酶底物法

Study on Detection of Escherichia coli in Drinking Water Based on Enzyme Substrate Method

ZHANG Ying， ZHAO Hui， SU Dongxia， CUI Yujuan， ZHAO Lu

（Beijing Yanqing District Center for Disease Control and Prevention， Beijing 102100， China）

Abstract： In order to understand whether the enzyme substrate method can quickly and accurately detect Escherichia coli in drinking water， water samples were collected from different locations， and standard detection method and enzyme substrate method were used  to detect Escherichia coli in drinking water at the same time. The results showed that 16 positive samples and 3 negative samples were detected by standard detection method， and 17 positive samples and 2 negative samples were detected by enzyme substrate method， there was no significant difference in the positive rate between the two methods （P>0.05）. The maximum probable number of 14 samples were consistent， and the maximum probable number of 5 samples were different. The sensitivity of enzyme substrate method was higher than that of standard method. The research provides data basis for rapid and efficient detection of microorganisms in drinking water.

Keywords： Escherichia coli; drinking water; enzyme substrate method

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然界的肠道细菌，可分为致病性与非致病性两大类，通常多数大肠埃希氏菌对人体无害。然而，当水源受到污染时，大肠埃希氏菌的数量会显著增加，从而对人体健康构成威胁。由此可以看出，检测大肠埃希氏菌可对饮用水的卫生情况做出评价[1-3]，准确检测饮用水中大肠埃希氏菌的含量是确保水质安全的关键。在大肠埃希氏菌检测方面，常见的标准检测方法以特定培养联合聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）检测为主，但该方法检测时间较长，通常需要3～5 d才能完成检测，而且操作过程复杂，不能满足快速检测的要求[4-5]。酶底物法是使用最小酶底物MMO-MUG（Minimal Media ONPG-MUG）作为底物，在一定温度下培养一定的时间，大肠埃希氏菌产生的β-半乳糖苷酶，将培养基中的无色邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷分解为黄色的邻硝基苯酚，同时大肠埃希氏菌又能产生β-葡萄糖醛酸酶，将培养基中的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷分解为4-甲基伞形酮，在紫外灯照射下产生荧光。酶底物法操作简单，结果呈现快速，特异性高[6-7]。

本研究从不同地点采集水样，利用酶底物法和标准检测方法同时检测大肠埃希氏菌，确定酶底物法的准确性和便捷性，为今后食品中微生物的快速、高效检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在北京市某地某餐饮店、某饮品店、某小区居民水龙头、二次供水水箱4个地点共采集40个样品，每个采样点采集10件样品。选择一次性无菌采样瓶进行采样，为消除活性氯和重金属离子的影响，在采样时加入硫代硫酸钠溶液消除活性氯影响，加入乙二胺四乙酸二钠溶液去除金属离子影响。

1.2 仪器与试剂

DH3600A恒温培养箱，河南沃林仪器设备有限公司；HulaMixer涡旋振荡仪，美国赛默飞公司；S2833-6K紫外线灯，盐城市诺信电子设备有限公司；HR30生物安全柜，深圳科力易翔仪器设备有限公司。

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC25922、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538、

假单胞菌（Pseudomonas）ATCC51821、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）ATCC13048作为质控样品，中国微生物菌种保存中心；MMO-MUG培养基、大肠杆菌肉汤、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤，美国赛默飞公司；伊红美蓝琼脂，南通恒凯生物科技发展公司；硫代硫酸钠溶液、乙二胺四乙酸二钠，天津科密欧试剂有限公司。在试验中所使用的各类试剂均按照参考《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》（GB 5750.12—2006）进行配制[8]。

1.3 试验方法

1.3.1 标准检测法

将待测样品接种于月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤，每管接种1 mL，在36 ℃培养箱中培养24 h后，从产气的管中挑取一环接种于大肠杆菌肉汤，在44 ℃培养箱中培养24 h。再从产气的管中划线接种于伊红美蓝琼脂培养基上，在36 ℃培养箱中培养24 h，观察平板上的菌落，挑取黑色的典型菌落进行纯化。之后对单菌落进行革兰氏染色，并进行生化鉴定，对照最大可能数（Maximum Probable Number，MPN）表查询MPN值[9-10]。

1.3.2 酶底物法

取1 mL待测样品接种于月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤，在36 ℃培养箱中培养24 h。取3 g MMO-MUG培养基溶于100 mL无菌水中，每个无菌试管中分装5 mL溶解完全的MMO-MUG培养基。用接种环从产气样品中挑取一环接种于分装好的MMO-MUG培养液中，在36 ℃培养箱中培养24 h后，将产生黄色反应的试管置于紫外线灯下进行观察，如果出现蓝色荧光，则表明该管大肠埃希氏菌呈阳性，并对照MPN表查出MPN值[9，11]。

1.4 试验设计

空白对照：每次试验用无菌水按照标准检测法和酶底物法步骤进行空白测定，培养后无颜色反应为正常。

产气对照：将产气肠杆菌制成300～3 000个/mL悬液，按照标准检测法和酶底物法步骤进行操作，培养基呈黄色，但在紫外灯照射下没有荧光为正常。

阴性和阳性对照：将阴性菌（金黄色葡萄球菌、假单胞菌）和阳性菌（大肠埃希氏菌）制成300～

3 000个/mL悬液，按照标准检测法和酶底物法步骤进行操作，阳性菌株呈现黄色荧光反应、阴性菌株呈现无色状态为正常。

1.5 数据处理

所有试验均重复3次，采用SPSS 20.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 质控样品检测分析

金黄色葡萄球菌和假单胞菌作为阴性菌培养后无颜色产生；产气肠杆菌培养后显黄色，没有蓝色荧光；大肠埃希氏菌作为阳性菌培养后显黄色，有蓝色荧光。质控样品检测正确，可用于酶底物法检测。

2.2 不同水样检测结果

检测的40份样品中有21份不产气，参考《食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数》（GB 4789.38—2012）[12]，鉴定为大肠埃希氏菌阴性。其他19份产气样品的检测结果如图1所示，其中有5份检测结果存在差异，酶底物法检测结果均高于标准检测法，其余14份检测结果一致。

标准检测法检测出16份阳性样品、3份阴性样品，酶底物法检测出17份阳性样品、2份阴性样品，如表1所示。利用t检验进行差异显著性分析，结果显示两种方法之间不存在显著性差异（P＞0.05）。

由表2可知，在5份有差异的组别数据中，酶底物法检测的MPN值均大于标准检测法，表明酶底物法检测灵敏度和特异性更高。

上述实验结果表明，在饮用水大肠埃希氏菌检测中，标准检测法与酶底物法的阳性检测率不存在显著性差异，两种方法对饮用水的检测结果在准确度上达成一致。

3 结论

对比分析标准检测法和酶底物法对饮用水中大肠埃希氏菌检测结果发现，两种方法在结果一致性、准确性方面无显著性差异，酶底物法能够作为评价饮用水中微生物污染情况的检测方法，而且该方法检测速度快、底物特异性强、评价效果准确。

总之，酶底物法在检测速度和底物特异性方面的优势使其成为评价饮用水中微生物污染情况的理想检测方法。同时，该方法不仅能够在饮用水检测中应用，在其他食品检测领域也具有广阔的应用前景。

参考文献

[1]韩吉娜，罗欣，朱立贤，等.大肠埃希氏菌的诱导耐酸响应及其交叉保护作用机制研究进展[J].食品科学，2023，44（11）：214-221.

[2]史方，李轲，阴甜甜，等.致病菌快速检测管联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法鉴定即食食品中的大肠埃希氏菌O157：H[J].食品安全质量检测学报，2023（1）：253-260.

[3]KARAKAYA E，AYDIN F，KAYMAN T，et al.Escherichia coli in different animal feces：phylotypes and virulence genes[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2023，39（1）：14.

[4]LIMA F R，SOBRINHO P D S C，ROCHA L D O F，et al.

Modeling of Listeria innocua， Escherichia coli， and Salmonella enteritidis inactivation in milk treated by gamma irradiation[J].Brazilian Journal of Microbiology，2023，54（2）：1047-1054.

[5]GONGGRIJP M A，VELTHUIS A G J，HEUVELINK A E，et al. Prevalence of extended-spectrum and AmpC β-lactamase-producing Escherichia coli in young calves on Dutch dairy farms[J].Journal of Dairy Science，2023，106（6）：4257-4265.

[6]徐庄艳.水中总大肠菌群酶底物法、滤膜法与多管发酵法的比较[J].净水技术，2022，41（增刊1）：356-359.

[7]王莉莉.酶底物光谱法与酶底物法检测水中大肠菌群的比较分析[J].净水技术，2024，43（3）：187-193.

[8]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.生活饮用水标准检验方法微生物指标：GB 5750.12—2006[S].北京：中国标准出版社，2006.

[9]蒋玉佳，颜军，谢超华，等.酶底物法快速检测食品中的大肠埃希氏菌[J].食品安全质量检测学报，2017，8（10）：3837-3840.

[10]赵智龙，姚汶艺，宫海燕，等.不同检测方法对鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌的鉴定结果比较及同源性分析[J].检验医学与临床，2022，19（5）：611-618.

[11]中华人民共和国生态环境部.水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法：HJ 1001—2018[S].北京：中国环境出版集团，2018.

[12]中华人民共和国卫生部，中国疾病预防控制中心营养与食品安全所.食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数：GB 4789.38—2012[S].北京：中国标准出版社，2012.