基于图像识别的酵母活细胞率快速测定系统

作者: 张小骥 秦磊磊 江一飞 何小艳 张雪琪

基于图像识别的酵母活细胞率快速测定系统0

基金项目:宜昌市自然科学研究项目(A23-2-037)。

作者简介:张小骥(1990—),男,湖北宜昌人,硕士,工程师。研究方向:食品安全。

摘 要:酵母活细胞率作为评判活性干酵母质量优劣的重要指标之一,准确快速地检测出结果显得尤为重要。本文针对传统方法进行活细胞率检测存在效率低、过程复杂等问题开发了一款计数软件,并将血球计数板替换为96孔细胞培养板进行计数。对比人工计数和软件计数在检测酵母活细胞率的误差以及采用不同容器进行检验的效率,结果表明,相对于人工计数,软件计数耗时更短,且误差较小;采用96孔细胞培养板批量检测比采用血球计数板耗时更短。

关键词:酵母计数;活细胞率;霍夫圆变换;图像处理

A Rapid Measurement System for the Survival Rate of Yeast Living Cells Based on Image Recognition

ZHANG Xiaoji, QIN Leilei, JIANG Yifei, HE Xiaoyan, ZHANG Xueqi

(Three Gorges Public Inspection and Testing Center, Yichang 443000, China)

Abstract: As one of the important indicators for evaluating the quality of active dry yeast, accurate and rapid detection of the results is particularly important. A counting software was designed for solving the issues of low efficiency and complex process in traditional method, blood cell counting plate is replaced by 96-well cell plate in this measurement system. Comparing the errors of manual counting and software counting in measuring survival rate of yeast living cells and the efficiency of different containers, the results reveal that software counting has less time consuming and errors compared with manual counting; compared with blood cell counting plate a significant advantage has shown in measuring a large number of samples by using 96-well cell plate.

Keywords: yeast counting; survival rate of living cells; Hough circle transform; image recognition

活性干酵母是鲜酵母经干燥脱水后仍保持生物活性的干制品[1],它是利用现代生物技术与生产工艺,将规模化生产的酵母细胞制成干物质含量超过95%的实用性酵母产品。活性干酵母除富含蛋白质和维生素外,还含有必需微量元素和生长因子,具有稳定性好、成本低廉、效果优良等特点[2]。酵母活细胞率是评判活性干酵母质量优劣的重要指标,目前常规的活细胞率检测方法为《酵母产品质量要求 第1部分:食品加工用酵母》(GB/T 20886.1—2021)中附录D,该方法原理为活细胞能将进入细胞的次甲基蓝染色剂还原为无色,死细胞由于无还原能力,次甲基蓝进入细胞后将其染成蓝色[3]。国家标准方法中采用血球计数板作为容器计数,通过人工计数方式统计血球计数板中4个视野内中方格里酵母细胞数,计算出活细胞率。该方法的缺点是每次使用完血球计数板需要反复清洗、晾干后才能进行下一次实验,不便于批量处理;人工细胞计数耗时长、易视觉疲劳,若期间受到干扰或打扰,常面临返工风险,效率低,出错率高。

笔者利用Python编写了计数软件替代人工计数,以解决以上难题。显微镜电子目镜采集图像后,通过霍夫圆变换识别所有酵母细胞,再将图片进行阈值分割及二值化变换,利用形态学方法处理图片,识别图中轮廓数,即可识别出死细胞个数。1块血球计数板单次只能测单个样品,而1块96孔细胞培养板可同时检测多个样品,且不需要清洗,批量处理速度快。以下对该软件计数方法进行介绍。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

仪器:全功能手动正置光学显微镜、恒温水浴

锅、电子天平、倒置荧光显微镜。试剂和耗材:次甲基蓝、氯化钾、碳酸氢钠、葡萄糖、氯化钠、六水氯化钙、96孔细胞培养板、血球计数板。

1.2 前处理方法

1.2.1 血球计数板前处理方法

称取高活性干酵母0.1 g于50 mL离心管,向其中加入20 mL生理盐水,温度为38~40 ℃,将离心管放入32 ℃水浴锅中活化1 h,活化完毕后,将离心管内样品混合均匀,再吸取混合液0.1 mL于

1 mL离心管,向其中加入次甲基蓝染色液0.9 mL,摇匀,室温下染色10 min,将盖玻片盖在血球计数板计数室上,使之紧紧盖在血球计数板上,吸取

20 μL染色后的溶液至血球计数板的计数室内,静置1~2 min,用正置显微镜观察[4]。正置显微镜下血球计数板细胞形态如图1所示。

图1 显微镜视野下血球计数板上酵母形态

1.2.2 96孔细胞培养板前处理方法

称取高活性干酵母0.1 g于50 mL离心管,向其中加入20 mL生理盐水,温度为38~40 ℃,将离心管放入32 ℃水浴锅中活化1 h,活化完毕后,将离心管内样品混合均匀,再吸取混合液0.1 mL于

1 mL离心管,向其中加入次甲基蓝染色液0.9 mL,摇匀,室温下染色10 min,取100 μL染色后溶液至96孔细胞培养板小孔内,静置1~2 min,用倒置显微镜观察。倒置显微镜下96孔细胞培养板中细胞形态如图2所示。

图2 显微镜视野下96孔细胞培养板上酵母形态

1.3 计数原则

1.3.1 人工计数

将载玻片放入显微镜中,在10倍目镜和16倍物镜下找到血球计数板中目标方格,再切换40倍物镜,调整焦距至视野最清晰处,开始对细胞计数,如果细胞在方格线上,则记上不记下,记左不记右。随机计数4个中方格(100个小方格)内酵母细胞数,结果取3次计数的算术平均值。无色透明的细胞为酵母活细胞,被染为蓝色的为酵母死细胞。

1.3.2 软件计数

在10倍目镜和16倍物镜下找到96孔细胞培养板中目标方格,再切换40倍物镜,调整焦距至视野最清晰处,开始计数,计数范围为视野内全部细胞,随机计数4个视野内细胞。

1.4 自动识别计数方法的实现

1.4.1 细胞总数识别计数原理

由于大多数种类酵母细胞在显微镜下呈类圆形[5],可利用霍夫圆变换检测显微镜视野下的酵母细胞数[6-7]。霍夫圆变换在图像处理中使用频率很高,可以用来检测图像中的圆形。该算法的原理是基于圆的数学特性,对图像中所有的像素点进行统计和梯度计算,找出圆心和半径,从而实现圆的检测。在霍夫圆变换中,首先需要对图像进行边缘检测,以便找出图像中的边缘。对可能组成圆的边缘像素点采取梯度计算,得到每个像素点的梯度值和方向。再将梯度值和方向转换为霍夫空间中的曲线,通过对曲线进行投票,找出圆心和半径[8]。在软件中调用霍夫圆变换法进行圆检测,需要将图像转换为灰度图像,流程见图3。

图3 总细胞计数流程

活的酵母细胞在显微镜视野下呈透明类圆形,死亡酵母细胞被次甲基蓝染色,呈蓝绿色透明类圆形(图4)。

图4 显微镜下酵母细胞

通过电子目镜将显微镜下视野截图并上传至计数软件识别计数,被计数软件统计的细胞外侧会标记圆圈(图5)。

图5 识别并标记的酵母细胞

1.4.2 死细胞识别计数原理

酵母死细胞染成蓝色,颜色明显区别于活细胞和背景。电子目镜拍摄图片为RGB色彩模式,是一种面向硬件的色彩模式,属于加法混色原理,RGB色彩模式中3个色彩分量之间联系紧密,只要亮度变化,分量值均会发生变化,且光线亮度对RGB值影响较大。因此,可以采用HSV色彩空间替代RGB色彩空间。相对于RGB色彩空间,HSV色彩空间能更直观显示出颜色的鲜艳程度、敏感程度等,方便人眼进行颜色对比[9-10]。HSV色彩空间相比于RGB色彩空间更容易实现对某种颜色的物体的追踪,也常用于分割指定颜色的物体。将图像转换为HSV色彩空间后,能使目标颜色更突出,更易通过设定阈值将图像二值化,排除背景干扰,留下感兴趣区域(Reigion of Interest,ROI)。将ROI区域图像进行优化处理后,即可识别并计数死细胞,识别流程见图6。

图6 死细胞识别计数流程图

(1)阈值分割。将RGB色彩空间转换为HSV色彩空间,观察者通过色调、饱和度和亮度能更好地感知颜色。从细胞的HSV图像可以发现,染色的死细胞与活细胞及背景的对比度较大[图7(a)],可以采用阈值分割法将死细胞和活细胞以及背景区分开。通过设定相应阈值,对图像进行二值化处理,在阈值范围内的点像素设为255,阈值范围外的点像素设为0,得到一副只有黑白点的图像,白点为死细胞轮廓[图7(b)]。

(2)形态学处理。图像二值化后虽然能将死细胞像素点分离出来,但设定阈值可能会导致部分组成单个死细胞的像素团中出现像素点不连续的情况,造成计数误差。因此,需要将组成同一细胞的像素点连接起来,同时将噪声点去除掉。本文采用图像形态学运算去除背景和连接组成同一细胞的像素点。腐蚀操作可以将图像中对象的边缘缩小和消除,达到去除特定像素的目的[11]。它可以用来将二值化图像中的前景部分进行收缩以及细化,可借此实现去除噪声的功能,见图8(a)。利用膨胀可将图像中像素对象的边界向外扩展,从而使得相邻的像素点或像素团连接在一起成为一个对象,该操作可以很好地弥补在腐蚀过程中造成的图像中间部分缺失的错误,从而达到将单个细胞像素点或像素团填充连接的效果,见图8(b)。

(3)计数。在二值化图像中,经过腐蚀、膨胀操作后,会留下多个独立的组成死细胞的像素团,对像素团计数即为死细胞数。但像素团多为不规则形,无法采用霍夫圆变换进行计数,此时可通过轮廓识别对像素团计数。图像轮廓是指图像中具有相同颜色或灰度值的连续点的曲线,可以有各种形状,通过对图像轮廓进行标记,可获得目标图像相关信息[12]。本文采用图像轮廓识别并标记死细胞,死细胞轮廓用黑色标记出来(图9)。

2 结果与分析

2.1 人工计数和软件计数结果差异

实验室选取了5个酵母产品测定活细胞率,采用96孔细胞培养板为容器,分别用人工计数和软件计数比对,结果如表1所示。相对于人工计数,软件计数中细胞总数和死细胞数略偏低(不采用软件中人工修正功能时),活细胞率的相对误差在3%以内。软件计数的数据偏低有以下几个原因:少量细胞不够圆,形态偏扁,软件无法识别为细胞;存在大量细胞团,少量细胞粘连程度高,无法分开计数;部分死细胞颜色偏浅,无法通过设置阈值将其分割出来。

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