微生物法测定婴幼儿奶粉中泛酸的优化研究

基金项目：云南省市场监督管理局科技计划项目（2022YSJK12，2022YSJK18）。

作者简介：陈明瑶（1992—），女，云南大理人，本科，助理工程师。研究方向：食品质量安全检测分析。

通信作者：张加稳（1989—），男，云南曲靖人，硕士，工程师。研究方向：食品质量安全检测分析。E-mail： 1098541655

@qq.com。

摘 要：通过优化《食品安全国家标准 食品中泛酸的测定》（GB 5009.210—2023）中微生物法测定婴幼儿奶粉中泛酸含量的关键实验条件和步骤，提高数据的重复性和准确性。结果表明，优化后，重复性实验的相对标准偏差为1.36%～2.38%，加标回收率在99.2%～104.2%，解决了国标法因菌种生长差异导致菌悬液浓度不稳定等问题，有效提高了检测数据的稳定性。

关键词：泛酸；微生物法；婴幼儿奶粉；实验条件优化

Optimization Study on Microbial Method for Determining Pantothenic Acid in Infant Milk Powder

CHEN Mingyao1， ZHAO Yincheng1， ZHANG Lianqin2， GUO Ying2， QIAN Zhou1， ZHANG Jiawen2*

（1.Yunnan Products Quality Supervision & Inspection Institute， National Tropical Agricultural Products Quality Supervision and Inspection Center， Kunming 650223， China;

2.Kunming Food and Drug Inspection Institute， Kunming 650034， China）

Abstract： The reproducibility and accuracy of the data were improved by optimizing the key test conditions and steps for the determination of pantothenic acid content in infant milk powder by microbial method in GB 5009.210—2023. The results showed that after optimization， the relative standard deviation of the repeatability test was 1.36%～2.38%， and the recovery rate of the spike was 99.2%～104.2%， which solved the problem of unstable bacterial suspension concentration caused by the difference in bacterial growth in the national standard method， and effectively improved the stability and reliability of the detection data.

Keywords： pantothenic acid; microbiological method; infant milk powder; experimental condition optimization

泛酸又称为维生素B5、本多生酸、遍多酸，是一种水溶性B族维生素，无臭、味微苦、偏酸性，在食物中普遍存在[1]。泛酸易溶于水和醋酸，在中性溶液中不易发生氧化还原作用，但易被酸碱破坏，对光敏感，检测时需要避光操作[2]。泛酸作为人体必需的维生素参与如脂肪、碳水化合物和蛋白质等多个代谢过程[3]，其参与制造的抗体可缓解因抗生素引发的毒副作用，减轻相应的过敏症状[4]。研究表明，婴幼儿摄入的泛酸含量不足时，会导致其体重下降、毛发和皮肤生长迟缓，甚至出现过敏、湿疹及免疫力低下等症状。此外，泛酸对婴幼儿的神经系统发育也有促进作用，可见泛酸对婴幼儿的生长和代谢都有重要作用[5]。目前，为满足婴幼儿生长发育对泛酸的正常需求，常把泛酸作为食品营养强化剂添加到婴幼儿配方食品中。由于婴幼儿食物来源单一，配方奶粉作为婴幼儿主要的营养物质来源之一，其中的泛酸含量显得尤为重要。

目前，微生物法是国内外测定婴幼儿奶粉中泛酸含量的主要方法之一，其检测原理是根据植物乳杆菌的生长和繁殖与泛酸存在的对应关系，利用泛酸含量与吸光度的线性关系计算样品中泛酸含量。微生物法的优势在于检测过程中干扰物质少、检出限低、成本低、灵敏度高，以及能够检测泛酸含量较低的样品，但此方法存在检测周期较长、偶然因素多、菌悬液浓度不稳定以及重复性差等不足[6]。本研究优化《食品安全国家标准 食品中泛酸的测定》（GB 5009.210—2023）中微生物法的关键实验条件及步骤，旨在提高测定结果的准确性和可重复性。

1 材料与方法

1.1 材料、菌种与试剂

3种市售婴幼儿奶粉，详细信息见表1。

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，ATCC 8014），

广东环凯微生物科技有限公司。泛酸钙标准品（98.8%），美国Sigma-Aldrich公司；乳酸杆菌琼脂培养基，美国BD公司；乳酸杆菌肉汤培养基、泛酸测定用培养基，广东环凯微生物科技有限公司；甲苯，分析纯，山东旭晨化工科技有限公司；乙酸钠、盐酸、乙醇，分析纯，北京化工厂。

1.2 仪器与设备

本实验使用的仪器与设备信息见表2。

1.3 实验方法

试剂及标准溶液的配制等按照GB 5009.210—2023[7]中微生物法相关步骤操作。

1.3.1 样品制备

（1）样品处理。将待测样品过筛3次（筛板孔径0.3 mm），分别准确称取0.700 g上述样品至100 mL锥形瓶中备用。

（2）待测样品制备。在装有待测样品的锥形瓶中加入80 mL乙醇溶液，超声提取4 h，用水定容至100 mL。随后将待测样品充分振荡摇匀，于

3 000 r·min-1离心10 min，在避光和无菌条件下，用无菌注射器吸取上清液至离心管中。根据表1中各待测样品的泛酸含量参考值，用0.9%的无菌生理盐水将试样提取液稀释相应倍数，并使最终浓度落在标准曲线范围内。3种待测样品均按上述方法处理，每种样品进行6次重复实验，以确保测定结果的准确性。

1.3.2 接种液的制备

在避光和无菌条件下，将现配的2 mL泛酸标准工作液与4 mL泛酸测定用培养液充分振荡混匀，分装于2支5 mL离心管，高压蒸汽灭菌15 min，取出后静置30 s，后放置于37 ℃恒温水浴锅中冷却。随后使用泛酸测定用琼脂培养基对菌株进行活化24 h。用接种环挑取经活化的单个植物乳杆菌，分别置于

2支种子培养液中，于37 ℃恒温培养箱中培养20 h后取出，以3 000 r·min-1冷冻离心10 min，弃上清液，在无菌操作下用预先灭菌的0.9%生理盐水淋洗2次，以3 000 r·min-1冷冻离心10 min，弃上清液，分别加入3 mL灭菌生理盐水，振荡混匀后备用。

利用紫外分光光度计于550 nm处测定接种液的透光率，确保透光率在60%～80%，若透光率不在该范围，则使用0.9%的无菌生理盐水稀释调整透光率至60%～80%。

1.3.3 标准系列管的制备

按照表3依次在10支15 mL试管中加入泛酸标准工作液、蒸馏水和泛酸测定用培养液[8]，待灭菌。

1.3.4 菌悬液浓度的优化

菌悬液浓度的高低取决于接种量和培养时间的长短，本实验将分别对接种量和培养时间进行优化筛选。

（1）接种量的优化筛选。制备10组完全相同的标准系列管，于121 ℃高压灭菌15 min后取出冷却至室温，在无菌条件下分别向每支测定管中滴加

5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL、35 μL、

40 μL、45 μL和50 μL的接种液，7 ℃恒温培养20 h后用紫外分光光度计在550 nm处测定各试管的吸光度值。以泛酸浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，利用ELISA Calc软件拟合泛酸标准曲线，以标准曲线线性关系最佳的接种量作为最优接种量。

（2）培养时间的优化筛选。选取最优接种量的标准系列管，测定不同培养时间（16～24 h）的吸光度，根据吸光度的变化，筛选最适宜的培养时间。

1.3.5 结果计算

以S0试管作为空白对照，在550 nm处测定各试管吸光值，以泛酸浓度（1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、

3 ng·mL-1、4 ng·mL-1、5 ng·mL-1、6 ng·mL-1、7 ng·mL-1、8 ng·mL-1、9 ng·mL-1和10 ng·mL-1）和吸光值为横坐标和纵坐标，绘制标准曲线，计算各待测样品中泛酸含量，计算公式为

（1）

式中：X为试样中泛酸含量，mg/100 g；为试样稀释液泛酸浓度均值，ng·mL-1；V为试样提取液的定容体积，mL；f为试样提取液稀释倍数；m为试样质量，g。

1.3.6 方法学评价

对待测样品检测结果进行精密度计算，并通过计算不同加标水平下的回收率，对优化后的检测方法进行方法学评价。

2 结果与分析

2.1 样品提取过程的优化

通过离心操作后，3种待测样品的提取液在

550 nm波长处的透光率比国标法制备的提取液透光率分别提高了23.7%、24.0%、30.2%，详见表4。

如图1所示，相较于国标中的提取方法，本实验提取方法不会使待测样品中原有泛酸含量损失，优化后各个样品中的泛酸含量比泛酸含量标示值

（表1）高6.75%、7.51%、5.86%，国标法测定的泛酸含量值比泛酸含量标示值高18.8%、11.3%、21.4%。这表明优化提取方法后泛酸的测定值更接近于产品泛酸含量的标示值。

2.2 接种液添加量筛选结果

对10组添加不同接种液的标准系列管进行标准曲线拟合，可得对应的相关系数r2值，详见表5。利用ELISA Calc软件拟合泛酸标准曲线，泛酸标准生长曲线呈平缓且单调的S形曲线，当各点均落于曲线上时，其线性关系最强。当接种量为30 μL时，线性关系最好，r2可达0.999 8。因此，选择30 μL作为本次实验的最优接种量。

2.3 培养时间的优化

以培养时间为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制30 μL接种量下菌液的生长曲线，结果见图2。当培养时间少于16 h时，菌悬液浓较低，吸光值增加缓慢，因此本文选取培养16～24 h进行详细分析。培养时间在16～19 h时，植物乳杆菌处于对数生长期，其生长速度较快，吸光值与培养时间呈正相关；当培养时间超20 h时，由于菌悬液浓度过高，吸光值趋于最大限度值（1）。当培养时间为20 h时，吸光值较高，菌液处于稳定生长期，所以选择20 h作为本实验的最适培养时间。

2.4 准确性与重复性实验