超高效液相色谱串联质谱法测定动物源食品中4种硝基呋喃代谢物

摘 要：本研究建立了超高效液相色谱串联质谱法同时检测动物源食品中3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-Amino-2-Oxazolidinone，AOZ）、5-吗啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-Amino-5-Morpholinomethyl-2-Oxazolidinone，AMOZ）、氨基脲（Semicarbazide，SEM）、1-氨基-2-内酰脲（1-Aminohydantoin，AHD）残留量的分析方法。样品以0.2 mol·L^-1盐酸水为提取剂，加入2-硝基苯甲醛为衍生剂，37 ℃水浴振荡4 h，调节pH值为7.4±0.2，HLB固相萃取柱净化，氮气吹干，用0.1%甲酸（含有50%甲醇）水溶液复溶，采用0.1%甲酸水-10 mmol·L^-1乙酸铵和甲醇为流动相梯度洗脱，经C18柱分离，电喷雾正离子模式扫描，多反应监测模式，内标法定量。结果表明，4种硝基呋喃药物线性良好，相关系数（R2）均大于0.999，动物源食品中AOZ、AMOZ、SEM、AHD的检出限均为0.2 μg·kg^-1，定量限为0.4 μg·kg^-1。低、中、高浓度加标水平下，4种化合物在畜肉产品中的回收率为87.42%～102.26%，相对标准偏差为0.80%～5.93%；在禽肉产品中的回收率为89.76%～104.94%，相对标准偏差为0.62%～5.83%；在禽蛋产品中的回收率为90.30%～106.82%，相对标准偏差为0.85%～7.93%；在水产品中的回收率为86.95%～107.36%，相对标准偏差为0.20%～5.02%。该方法灵敏度高、重复性好，可为实验室大批量检测动物源食品中硝基呋喃类药物提供技术参考。

关键词：超高效液相色谱串联质谱；动物源食品；硝基呋喃类药物

Determination of Four Nitrofuran Metabolites in Animal Derived Food by Ultra-High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

BIAN Wenke WANG Runhao

（1.College of Agricultural Engineering and Food Science， Shandong University of Technology， Zibo 255049， China;

2.Shandong Burey Inspection and Testing Co.， Ltd.， Zibo 256400， China）

Abstract： In this research， an ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was developed for the simultaneous determination of 3-amino-2-oxazolidinone （AOZ）， 5-morpholinomethyl-3-amino-2-oxazolidinone （AMOZ）， semicarbazide （SEM） and 1-aminohydontion （AHD） residues in food from animal origin. These samples were treated with 0.2 mol·L^-1 hydrochloric acid water as an extract and 2-nitrobenzaldehyde as derivative. Samples were shaken in a water bath at 37 ℃ for 4 h， and the pH was adjusted to 7.4±0.2， and purified by HLB solid phase extraction column， then dried by nitrogen， used 0.1% formic acid water to redissolve （included 50% methanol）， 0.1% formic acid water are mixed with 10 mmol·L^-1 ammonium acetate and methanol as mobile phase to gradient. C18 column to separation， scanning electrospray positive in ion mode and multi-reaction monitoring mode， quantification by internal standards. The results showed that the four nitrofuran drugs had good linearity， and correlation coefficients （R2） were all greater than 0.999. The detection limits of AOZ， AMOZ， SEM and AHD in animal food were all 0.2 μg·kg^-1， and quantitation limits were 0.4 μg·kg^-1. At low， medium and high concentration addition levels， the recovery rates of the four compounds in livestock meat products were 87.42%～102.26%， and the relative standard deviations were 0.8%～5.93%; the recovery rates in poultry meat products were 89.76%～104.94%， the relative standard deviations were 0.62%～5.83%; the recovery rates in poultry egg products were 90.30%～106.82%， the relative standard deviations were 0.85%～7.93%; the recovery rates in aquatic products were 86.95%～107.36%， and the relative standard deviations were 0.20%～5.02%. The the method has high sensitivity and good repeatability， which providing technical reference for the detection of nitrofurans in large quantities of animal food in laboratory.

Keywords： ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; animal derived food; nitrofuran drugs

硝基呋喃类药物是一种广泛应用于水产养殖类、畜禽产品中的广谱抗生素。硝基呋喃类药物对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用[1]。硝基呋喃类药物作用于微生物酶系统，抑制乙酰辅酶A，干扰微生物糖类代谢，从而起到抑菌作用[2]。硝基呋喃类药物广泛应用于畜禽及水产养殖业，主要治疗大肠杆菌和沙氏门菌引起的肠炎等疾病[3]。硝基呋喃类药物在动物体内代谢后，产生的硝基呋喃类代谢物极易与蛋白质结合，并且这些蛋白质结合物能在人体中残留很长时间，采用蒸煮、烘烤等方式均不能使其降解，对人体健康构成了威胁[4]。因此，硝基呋喃类代谢物的检测是保障食品安全的重要环节。

目前对于硝基呋喃类代谢物常见的检测方法有高效液相色谱法[5-6]、液相色谱串联质谱法[7-15]、免疫分析法[16-19]。其中免疫分析具有操作简单、成本低、快速等优点，但大批量任务检测时极易出现假阳性，只能快速定性分析，无法准确定量分析，适用于实验室检测样品的初步筛选。高效液相色谱法具有重现性好、结果准确等优点，但高效液相色谱法抗干扰能力差，极易受其他杂质影响，在实际样品检测中受到一些限制。超高效液相色谱串联质谱法具有灵敏度高、结果准确、快速等优点，可分析基质复杂的样品，能够做到准确定性、定量分析。硝基呋喃分子量小，可以通过衍生化生成大分子量稳定的化合物，因此采用超高效液相色谱串联质谱法（Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）来测定。目前，硝基呋喃代谢物检测常用的标准《食品安全国家标准 水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB 31656.13—2021）只适用于水产品的检测、《动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱/串联质谱法》（GB/T 21311—2007）涉及动物源产品的检测，两个标准都采用液液萃取法进行净化提取。这对于基质复杂的畜禽肉、禽蛋、水产品有一定的局限性，在萃取过程中极易发生乳化现象。本研究在GB 31656.13—2021和GB/T 21311—2007两个标准的基础上，建立了动物源食品中4种硝基呋喃及其代谢物的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉、鸡蛋、鸡肉、清江鱼：购于淄博市超市。

甲醇、乙腈、乙酸铵：色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司；盐酸、氢氧化钠、无水硫酸钠、磷酸二氢钾：分析纯，国药化学试剂集团有限公司；甲酸：色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司；2-硝基苯甲醛（纯度99.9%）：色谱纯，国药麦克林；正己烷：色谱纯，上海阿拉丁试剂有限公司，乙酸乙酯：色谱纯，上海默克化工技术有限公司；二甲亚砜：分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；实验室用水：一级水，娃哈哈；3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-Amino-2-Oxazolidinone，AOZ）、5-吗啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-Amino-5-Morpholinomethyl-2-Oxazolidinone，AMOZ）、氨基脲盐酸盐（Semicarbazide Hydrochloride，SEM·HCl）、1-氨基-2-内酰脲（1-Aminohydantoin，AHD）4种硝基呋喃代谢物标准品：100 μg·mL-1；3-氨基-2-噁唑烷基酮-D4（AOZ-D4）、5-吗啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮-D5（AMOZ-D5）、氨基脲盐酸盐-13C，15N2（SEM·HCl-13C，15N2）、1-氨基-2-内酰脲-13C3（AHD-13C3）4种硝基呋喃代谢物同位素标准品：100 μg·mL-1。

1.2 仪器与设备

TGL-16M高速冷冻离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；TN-5800氮吹浓缩仪：天津奥特塞恩斯仪器有限公司；anavo HLB固相萃取柱，500 mg/12 mL，北京纳鸥科技有限公司；XH-C涡旋混合器：常州越新仪器制造有限公司；TSQ Quantival UPLC-MS/MS超高效液相-质谱连用仪，配有TraceFinder 4.1 General Quan数据处理软件：赛默飞世尔科技有限公司；PHS-25酸度计：上海雷磁仪器有限公司；SHA-B数显恒温水浴振荡器：天津奥特塞恩斯仪器有限公司；有机相微孔滤膜，13 mm×0.22 μm：上海安谱实验科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 混合标准溶液配制

准确移取4种硝基呋喃代谢物混标适量于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为1 μg·mL^-1、100 μg·L^-1、10 μg·L^-1的混合标准储备液。取4种硝基呋喃代谢物同位素混合标准品适量于10 mL棕色容量瓶中，配制成浓度为1 μg·mL^-1的混合中间液。

1.3.2 样品制备

取猪肉、鸡肉、鱼肉肌肉组织500 g切成小块后置于捣碎机中，将其捣碎后分别置于3个不同的样品盒中，贴标签备用。取鸡蛋500 g去壳后打入捣碎机中，用捣碎机将其充分搅拌混匀，倒入样品盒中，贴标签备用。

1.3.3 样品前处理

（1）提取。称取2 g样品于50 mL离心管中，加入4种硝基呋喃同位素工作液（1 μg·mL^-1）20 μL，加入0.05 mol·L^-1 2-硝基苯甲醛300 μL，加入0.2 mol·L^-1盐酸水15 mL，37 ℃水浴振荡4 h。用磷酸氢二钠与氢氧化钠调节pH值为7.4±0.02，加入5 mL正己烷除油脂，于4 ℃ 8 000 r·min^-1离心10 min，取下清液于另一只50 mL离心管中备用，若下清液浑浊则加入5 mL正己烷再次除油。（2）净化。用5 mL甲醇、5 mL水活化柱子，将下清液以2～3 mL·min^-1的速度流过柱子，用5 mL蒸馏水淋洗柱子并且吹干，用10 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液于50 ℃下氮吹至尽干，加入2 mL 0.1%甲酸水∶甲醇（1∶1）试剂复溶，涡旋混匀，过0.22 μm尼龙有机滤膜于进样小瓶中，经UPLC-MS/MS测定。