分光光度法测定破壁灵芝孢子粉中总三萜含量研究

作者: 谢林云 李丹

分光光度法测定破壁灵芝孢子粉中总三萜含量研究0

摘 要:目的:优化分光光度法测定破壁灵芝孢子粉中总三萜含量的分析方法。方法:分别针对方法中提取液除杂方式、挥干方式及水浴反应条件等进行优化,并对优化后的方法线性、检出限、定量限、准确性、专属性及重复性等进行验证。结果:测试方法中挥干方式为沸水浴挥干、除杂方式为4 000 r·min-1离心10 min、水浴条件为60 ℃反应15 min;熊果酸标准溶液在20~160 μg范围内线性良好,相关系数R2为0.999 2,加标回收率在93.12%~97.73%,相对标准偏差低于0.64%,方法检出限为0.120 3 μg·mL-1,定量限为0.361 0 μg·mL-1。结论:该方法操作简便,条件明确,具有良好的准确度和精密度,适用于破壁灵芝孢子粉中总三萜含量测定。

关键词:分光光度法;破壁灵芝孢子粉;总三萜

Abstract: Objective: To optimize the spectrophotometric analysis method for the determination of total triterpenoids in Ganoderma lucidum spore powder. Method: The extraction method of impurity removal, evaporation method and water bath reaction conditions were optimized, and the linearity, detection limit, quantification limit, accuracy, specificity and repeatability of the optimized method were verified. Result: The evaporation method was boiling water bath evaporation, impurity removal method was 4 000 r·min-1 centrifugation for 10 min, and water bath condition was 60 ℃ reaction for 15 min. The standard solution of ursolic acid had good linearity in the mass concentration range of 20 μg to 160 μg, the correlation coefficient R2 was 0.999 2, the recovery rate was between 93.12% and 97.73%, the relative standard deviation was lower than 0.64%, the method detection limit was 0.120 3 μg·mL-1, and the quantification limit was 0.361 0 μg·mL-1. Conclusion: This method is simple to operate, the conditions are clear, and the test results are highly accurate, which is suitable for the determination of total triterpenoid content in Ganoderma lucidum spore powder.

Keywords: spectrophotometry; Ganoderma lucidum spore powder; triterpenes

灵芝(Ganoderma lucidum)又称为菌灵芝,是灵芝科灵芝属真菌的总称[1-2]。灵芝最早记录于西汉时期《淮南子·修务训》[3-4],《神农本草经》[5-8]将“青芝、赤芝、黄芝、紫芝、黑芝、白芝”六芝列为草部上品之首[9],其中赤芝和紫芝为《中华人民共和国药典》(2000版)首次收载[10]。灵芝具有抗肿瘤、抗衰老、降低血糖血脂及免疫调节等作用[11]。目前市面上的灵芝制品有破壁灵芝孢子粉、灵芝孢子油、灵芝孢子油软胶囊等,以破壁灵芝孢子粉居多。破壁灵芝孢子粉是一种重要的保健食品原料,三萜类化合物是破壁灵芝孢子粉中最主要的活性成分[12],具有多种生理活性,如保肝护肝[13]、抗炎[14]、降血糖[15]、抗肿瘤[16]、抗氧化[17]、神经保护[18]等,应用前景广泛。因此,三萜类化合物含量可作为评价破壁灵芝孢子粉质量高低的一项重要指标。

三萜类化合物是一类基本母核由30个碳原子所组成的萜类化合物,含有-(C5H8)n-通式及含氧衍生物,由6个异戊二烯单位聚合而成。近年来,灵芝三萜逐渐受到研究者的重视,相关报道日渐增多,测定灵芝三萜含量的方法主要分为分光光度法和液相色谱法:液相色谱法准确度高,但需要大量的高纯度三萜类化合物作为标准品,要分离获得高纯度具有代表性的三萜化合物对照品技术难度很大;分光光度法准确度虽不如液相色谱法,但能以目前自然界广泛存在的三萜化合物熊果酸、齐墩果酸作为对照品。目前破壁灵芝孢子粉中总三萜含量测定基本采用分光光度法。

现有的破壁灵芝孢子粉中总三萜含量的分光光度方法诸多条件存在不明确的问题:《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则》(2020年版)中使用了离心,但是并未明确离心的条件;《保健食品功效成分检测方法》一书中针对总三萜含量测试方法的描述有,样品提取后溶液浑浊可过滤等[12],但并未定义如何判断浑浊。因破壁灵芝孢子粉极易产生悬浮,相关测试条件不明确将导致测试结果不准确、重现性差等问题。破壁灵芝孢子粉中总三萜的准确测定现为业内公认的技术难点,因此急需对测试方法进行优化,明确测试条件并验证方法的可靠性。

本研究使用分光光度法测定破壁灵芝孢子粉中总三萜含量,通过对方法中挥干方式、除杂方式、水浴条件等进行优化,对所确立的方法线性范围、检出限与定量限、专属性、重复性、准确性、耐用性等进行评价,验证本方法的适用性、可靠性及优越性,为食品分析、检测以及质量控制提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

熊果酸标准品(纯度94.7%,CAS号77-52-1),BePure;乙酸乙酯、冰乙酸(分析纯),天津大茂试剂厂;三氯甲烷(分析纯),广州试剂厂;高氯酸(优级纯),成都市科隆公司;香草醛(分析纯),天津科密欧公司。

1.2 仪器与设备

UV-1800光度计(SHIMADZU);ME204E、ME155DU分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);恒温水浴锅(常州普天公司);XWDS-1018ST超声波清洗器(东莞市万德盛自动化设备公司);L-530离心机(湖南湘仪)。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液配制

熊果酸标准品溶液(100 μg·mL-1):准确称取熊果酸标准样品10 mg至100 mL容量瓶中,加乙酸乙酯超声溶解,定容,摇匀。

香草醛-冰乙酸溶液(50 mg·mL-1):准确称取香草醛5.0 g,加冰乙酸使溶解并定容至100 mL,即得。临用前配制。

1.3.2 试样制备

准确称定试样0.1 g(相当于总三萜质量为0.5~5.0 mg),置于50 mL容量瓶,加三氯甲烷约30 mL,50 kHz超声处理30 min,0 ℃水浴冷却,加三氯甲烷定容,混匀,转移静置30 min,4 000 r·min-1离心10 min,移取上清液测用。

1.3.3 标准曲线的制作

准确移取熊果酸标准使用溶液0 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL和1.00 mL于比色管中,沸水浴挥干,冷却后精密加入0.40 mL香草醛-冰乙酸溶液,转动比色管使残渣溶解,再准确加入1.0 mL高氯酸,混匀后放置60 ℃水浴中反应15 min,取出,0 ℃冰浴冷却,精密加入冰乙酸5.0 mL摇匀,15 min后转移至比色皿中,在548 nm波长测定吸光度。以吸光度为纵坐标,标准品质量为横坐标绘制标准曲线。

1.3.4 试样溶液的测定

精密量取试样上清液1.0 mL置10 mL比色管中,沸水浴挥干,冷却后精密加入0.4 mL香草醛-冰乙酸溶液,转动比色管使残渣溶解,再准确加入1.0 mL高氯酸,混匀后放置60 ℃水浴中反应15 min,取出,0 ℃冰浴冷却,精密加入冰乙酸5.0 mL摇匀,15 min后转移至比色皿中,在548 nm波长测定吸光度,根据标准曲线计算样品溶液中总三萜的含量。

1.3.5 数据处理

试样中总三萜(以熊果酸计)含量按公式(1)计算。

式中:X为试样中总三萜(以熊果酸计)含量,g/100 g;C为标准曲线查得待测样液中熊果酸质量,μg;m为试样质量,g;V1为试样三氯甲烷定容总体积,mL;V2为移取试样上清液体积,mL。

2 结果与分析

2.1 测定波长的选择

取熊果酸标准溶液和破壁灵芝孢子粉三萜提取溶液,经香草醛-冰乙酸和高氯酸显色后,在450~700 nm扫描,获得吸光度曲线见图1。由图1可知,在548 nm波长处熊果酸有最大吸收,在550 nm处破壁灵芝孢子粉三萜有最大吸收,两者最大吸收波长基本一致,符合《中华人民共和国药典》(2020版)最大波长允许误差范围要求,故确定548 nm为测定波长。

2.2 灵芝制品的选择

选择不同类型的灵芝制品(破壁灵芝孢子粉、灵芝孢子油、灵芝孢子油软胶囊),按照《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则》(2020年版)中规定的方法进行测定,结果如表1所示。通过测试结果可以看出,破壁灵芝孢子粉的相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)较大,且与理论值偏差较大,故选择破壁灵芝孢子粉作为进一步优化研究基质。

2.3 条件优化

2.3.1 除杂方式的考察

在样品制备阶段,除杂方式可分为滤纸过滤、0.45 μm有机相滤膜过滤、4 000 r·min-1离心(分别设置离心时间5 min、10 min、20 min)3种。表2结果表明,3种方式的结果都比较稳定,滤纸过滤和0.45 μm有机滤膜过滤的测试结果与理论结果有一定的偏差,离心方式的测试结果更接近理论值。在离心时间的选择方面,不同离心时间状态如图2所示,离心10 min后上清液澄清无肉眼可见悬浮颗粒。因此,选择4 000 r·min-1离心10 min作为除杂方式进行试验。

2.3.2 挥干方式的考察

在样品测定阶段,挥干方式可分为沸水浴挥干、105 ℃烘箱烘干、60 ℃水浴蒸干、氮气吹干4种方式,表3结果表明:沸水浴挥干方式RSD为1.05%,结果稳定,重现性比其他方式更好。后续选择沸水浴挥干进行试验。

2.3.3 水浴条件的考察

样品测定阶段,分别在60 ℃+10 min、60 ℃+15 min、60 ℃+45 min、65 ℃+15 min和70 ℃+15 min 5种条件组合下,考察反应温度和时间对测试结果的影响(表4)。可以发现,测定值与水浴温度和水浴时间呈正相关:温度控制在60 ℃不变时,随水浴时间增长测试结果变大;当水浴时间均控制在15 min时,随着水浴温度升高测试结果变大。结果表明,60 ℃+15 min条件下测试结果与理论值更接近,偏差最小,因此选择此水浴条件。

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