HPLC-MS法同时检测鱼肉中32种兽药残留

摘 要：用PLS-A固相萃取小柱处理鱼肉样品，采用高效液相色谱-串联质谱法对鱼肉中的32种兽药残留进行测定。实验优化了样品提取方法、色谱条件，并研究了方法的线性范围、准确度、精密度以及基质效应。结果表明，32种兽药的回收率在75.3%～114.7%，检出限为1.0 μg·kg-1，相对标准偏差均小于15%（n=6），32种兽残在1～100 ng·mL-1线性关系良好，相关系数均高于0.991。该方法准确度高、精密度好，可为鱼肉中32种兽药残留的检测提供技术支撑。

关键词：高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS）；兽药残留；PLS-A；鱼肉

Simultaneous Determination of 32 Veterinary Drugs in Fish by High performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Yanlong， HUANG Leipeng， HAN Xuegong， WANG Zhaoquan

（Changyi Center for Inspection and Testing， Changyi 261300， China）

Abstract： In this experiment， a PLS-A solid-phase extraction column was used to treat fish meat samples， and high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was used to determine the residues of 32 veterinary drugs in fish meat. The experiment optimized the sample extraction method and chromatographic conditions， and studied the linear range， accuracy， precision， and matrix effects of the method. The results showed that the recovery rates of 32 veterinary drugs ranged from 75.3% to 114.7%， with a detection limit of 1.0 μ g·kg-1 and a relative standard deviation of less than 15% （n=6）， there was a good linear relationship between the 32 animal residues in the range of 1～100 ng·mL-1， with correlation coefficients higher than 0.991. This method has high accuracy and good precision， and can provide technical support for the detection of 32 veterinary drug residues in fish meat.

Keywords： high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS）; veterinary drug residues; PLS-A; fish

我国在畜牧养殖领域使用较多的兽药主要有磺胺类、五氯酚酸钠、孔雀石绿类、β受体激动剂类、四环素类、氯霉素类和喹诺酮类等化合物[1]。而药物滥用是造成畜牧产品污染的主要原因之一。药物残留通过代谢途径进入动物肌肉等组织中，最终通过食品链进入人体，这不仅会引发过敏反应，还可能增加人体对药物产生抗药性的风险。目前，兽药残留的检测方法通常基于兽药种类进行分类，这造成了检测方法的多样性和前处理方法的不统一[2]。大多数检测方法的前处理过程烦琐，且回收率较低，此外，开发能同时检测多种兽药残留的液相色谱-质谱法面临一定的挑战[3]。鉴于实验室人员有限、样品种类多、检测项目复杂以及检测工作量大等现状，在本方法中，样品处理采用迪马科技PLS-A固相萃取小柱，无须进行活化和平衡步骤，且提取液直接通过小柱，能够有效去除蛋白、盐、磷脂等95%以上的基质干扰物。该方法简便、快速，能同时检测国家食品安全监督抽检实施细则中规定的32种兽药残留，其不仅缩短了检测周期，还在降低检测成本的同时大幅提升了检测效率[4]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈（色谱纯）；甲酸（色谱纯）；屈臣氏专业蒸馏水；90%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；10%乙腈水溶液；32种兽药标准品（浓度为100 μg·mL-1）。

1.2 仪器与设备

TSQ Quantum Ultra液相色谱质谱联用仪；C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；GTCS-2013B垂直振荡器；KQ-700DE型数控超声波清洗器；TGL-20M低温离心机；EA32型多功能样品浓缩仪。

1.3 标准溶液配制

标准品溶液（100 μg·mL-1）。混合标准品工作液（1.0 μg·mL-1）：取各标准品储备溶液50 μL于5 mL容量瓶，用乙腈定容至5 mL。混合标准品工作液（0.1 μg·mL-1）：取500 μL混合标准品工作液于5 mL容量瓶，用乙腈定容至5 mL。

1.4 基质匹配标准曲线的制备

精密量取0.1 μg·mL-1混合标准工作液10 μL和30 μL，以及1.0 μg·mL-1混合标准工作液10 μL、20 μL、50 μL和100 μL，分别加入6份经提取和净化的样品空白中，50 ℃水浴氮气吹干，加10%乙腈水溶解残余物并定容至1 mL，配制成浓度为1 ng·mL-1、3 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1的基质匹配系列混合标准溶液，过0.22 μm滤膜，上机测定。

1.5 样品处理

取2.50 g（精确到0.01 g）样品，加入10 mL 90%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）提取，振荡5 min，超声5 min，5 000 r·min-1离心5 min，取出上清液加入PLS-A柱中，接收4 mL流出液；将流出液在50 ℃水浴条件下氮吹至0.5 mL左右，用10%乙腈水溶液定容至1 mL，过0.22 μm微孔滤膜后，待测。

1.6 仪器条件

1.6.1 正离子模式

（1）色谱条件。色谱柱：C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流动相：A相为乙腈，C相为添加0.1%甲酸的水溶液；流速：0.25 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；梯度洗脱见表1。

（2）质谱条件。离子模式：电喷雾离子源；扫描方式：正离子模式；检测方式：多反应监测模式；电喷雾电压：3 500 V；雾化器压力：40 arb；辅助气压力：10 arb；气帘气压力：0 arb；离子源温度：350 ℃；离子传输管温度：300 ℃。

1.6.2 负离子模式

（1）色谱条件。色谱柱：C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流动相：A相乙腈，C相水；流速：0.25 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；梯度洗脱见表1。

（2）质谱条件。离子模式：电喷雾离子源；扫描方式：负离子模式；检测方式：多反应监测模式；电喷雾电压：-2 800 V；雾化器压力：40 arb；辅助气压力：10 arb；气帘气压力：0 arb；离子源温度：350 ℃；离子传输管温度：300 ℃。32种兽药的质谱参数表见表2。

2 结果与分析

2.1 提取液的选择

分别采用乙腈、乙酸乙酯和90%乙腈水（含0.1%甲酸）溶液进行样品提取。由表3可知，与乙酸乙酯相比，乙腈的提取效率较高、成本更低，且用含水的乙腈提取液可明显提升喹诺酮类、四环素类兽药的提取效率；当使用90%乙腈水（含0.1%甲酸）溶液作为提取溶剂时，32种兽药及其代谢物的回收率均可维持在75.3%～114.7%。因此，选择90%乙腈水（含0.1%甲酸）溶液作为本实验提取液。

2.2 流动相的确定

本实验在正离子模式下选择乙腈∶水、甲醇∶水和乙腈∶0.1%甲酸水作为流动相。有机相为乙腈时，各物质均能实现较好分离且柱压较低；水相为0.1%甲酸水时，可改善各物质峰型提高响应值。因此，选择乙腈∶0.1%甲酸水作为流动相。

2.3 方法检出定量限、回收率、精密度

在优化条件下，将1.4的系列混合标准溶液上机测定，以特征离子峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。分别以3倍信噪比和10倍信噪比时的质量浓度来定义方法检出限和方法定量限。由表4可知，32种兽药化合物在1～100 ng·mL-1范围内线性关系良好，相关系数r均在0.991以上；

32种兽药化合物的方法检出限为1.0 μg·kg-1，定量限为3 μg·kg-1，符合兽药残留检测标准。

对样品进行加标（加标水平为1 μg·kg-1、20 μg·kg-1、100 μg·kg-1）回收实验。由表4可知，回收率（采用基质匹配标准溶液定容）为75.3%～114.7%，相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）为2.4%～11.9%。结果表明此方法精密度和准确度均符合兽药残留检测标准。

2.4 基质效应

在液相色谱-质谱联用中，基质效应是决定检测结果是否准确的影响因素之一，较强的基质效应对结果可产生较大的影响[5]。基质效应为基质标与溶剂标的比值，由表5可知，诺氟沙星、培氟沙星、恩诺沙星、四环素和土霉素5种化合物存在离子增强作用，其他27种化合物均存在离子抑制作用。

3 结论

本研究开发的方法通过合并和简化前处理步骤，避免了对固相萃取柱的活化过程，实现了对多种兽药残留的同时检测。这种方法不仅缩短了前处理时间，还降低了检测成本。它能够在确保准确性的同时提高检测速度，简化操作过程。此外，该方法还满足了同时处理多批次、多兽残样品的需求，符合现代食品安全检测的高效率和高准确性要求。

参考文献

[1]刘培勇，张惠，米之金，等.两步液液萃取-固相萃取净化结合高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中11种磺胺类兽药残留[J].色谱，2019，37（10）：1098-1104.

[2]王一涵，王展华，陈万勤，等.固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱法同时测定猪肉中14种大环内酯类兽药残留[J].分析测试学报，2019，38（10）：1247-1253.

[3]李华，杨娟，陈黎.超高液相色谱-串联质谱法测定猪肉中8种喹诺酮类兽药残留的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2017，8（8）：3237-3243.

[4]方从容，高洁，王雨昕，等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中125种兽药残留[J].色谱，2018，36（11）：1119-1131.

[5]ORTELLI D，COGNARD E，JAN P，et al.Comprchensive fast multiresidue screening of 150 veterinary drugs in milk by ultra-performance liquid chromatogapby coupled to time of flight mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B，2009，877（23）：2363-2374.