高效液相色谱法测定乳制品中泛酸的测量不确定度评定

摘 要：目的：评定高效液相色谱法测定乳制品中泛酸的测量不确定度。方法：根据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012），采用《食品安全国家标准 食品中泛酸的测定》（GB 5009.210—2023）第一法高效液相色谱法，结合不确定度评定，对乳制品中泛酸含量进行测定后建立数学模型，分析并评定不确定度来源。结果：通过对不确定度各分量进行量化和合成，结果显示乳制品样品中泛酸的含量为15.86 mg/100 g，扩展不确定度为0.50 mg/100 g（k=2）。结论：本实验不确定度主要集中在泛酸加标试验回收率、各标准溶液的配制和标准曲线的拟合过程，相比之下，样品的称量及其前处理过程引入的不确定度分量相对最小。

关键词：乳制品；泛酸；高效液相色谱法；不确定度

Evaluation of Measurement Uncertainty for Determination of Pantothenic Acid in Dairy Products with High Performance Liquid Chromatography

LU Yuefen， LIU Yanyun， WANG Ruogu*

（Beihai Public Inspection and Testing Center， Beihai 536000， China）

Abstract： Objective： Evaluation of uncertainty for determination of pantothenic acid in dairy products by high performance liquid chromatography. Method： According to JJF 1059.1—2012， reference to the first method of

GB 5009.210—2023， combining uncertainty assessment， established a mathematical model to determine the content of pantothenic acid in dairy products by liquid chromatography， analyzed and evaluated the sources of the uncertainty. Result： By quantifying and synthesizing the various components of uncertainty， the results showed that the content of pantothenic acid in the dairy product sample was 15.86 mg/100 g， and the extended uncertainty was

0.50 mg/100 g （k=2）. Conclusion： This experiment showed that the preparation of standard solution and curve fitting has a great influence on the accuracy of the results， and the repeatability determination has a smaller influence on the accuracy of the results.

Keywords： dairy products; pantothenic acid; high performance liquid chromatography; uncertainty

乳制品中的泛酸，也称维生素B5，又名“遍多酸”，是一种水溶性维生素，也是人体生长发育必需的一种重要营养物质，其与人体的免疫调节密切相关[1]，而缺乏泛酸可能会导致阿尔茨海默病[2]。我国预包装食品标签20种可选择营养成分的功能声称标示情况中，泛酸的声称实际标示率为0，处于最低位[3]。2023年9月6日，我国发布的《食品安全国家标准 食品中泛酸的测定》（GB 5009.210—2023）[4]中除液相色谱法、微生物法，新增了液相色谱-串联质谱法。目前泛酸的检测方法还有定量毛细管电泳法[5]、胶束电动色谱法[6]等。

乳制品是本实验室日常抽检的食品类别，本实验按照《化学分析测量不确定度评定》（JJF 1135—2005）[7]和《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[8]的要求，参照《食品安全国家标准 食品中泛酸的测定》（GB 5009.210—2023）中的液相色谱法[4]对乳制品中的泛酸进行测定，使本实验室能更好地满足《检验和校准实验室能力认可准则》（CNAS-CL01：2018）[9]中日常检验工作质量控制的要求。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

实验的乳制品样品由政府抽检提供；D-泛酸钙标准品（纯度98.5%，坛墨质检科技股份有限公司）；乙腈（色谱纯，Fisher公司）；磷酸（分析纯，成都科隆公司）；盐酸（分析纯，成都科隆）；磷酸二氢钾（分析纯，天津大茂）；七水合硫酸锌（分析纯，成都科隆）；微孔滤膜（0.45 μm，Anpel公司）。

XS 205DU电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；XH-C旋涡混合器，常州朗越仪器制造有限公司；AS 30T超声波振荡器，安莱立思仪器科技（上海）有限公司；ST 40R高速冷冻离心机，赛默飞世尔；S210 pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；1200高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

（1）泛酸标准储备溶液的配制（500 μg·mL-1）。精密称取纯度为98.5%的D-泛酸钙标准品55.10 mg，溶解后转移至100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度线，摇匀后-18 ℃及以下避光保存。

（2）泛酸标准中间溶液的配制（100 μg·mL-1）。精密吸取泛酸标准储备溶液20.0 mL于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度线，临用现配。

（3）泛酸标准曲线溶液的配制。分别精密吸取泛酸标准中间液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、8.0 mL、16.0 mL和32.0 mL于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度线，得到浓度分别为1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、8.0 μg·mL-1、16.0 μg·mL-1和32.0 μg·mL-1的泛酸标准系列工作溶液，以供高效液相色谱仪测定。

1.2.2 样品前处理

准确称取5 g试样（精确至0.001 g）于100 mL锥形瓶中，加入约30 mL 40 ℃温水，超声提取20 min。用0.1 mol·L-1的盐酸溶液将样品pH值调节至5.0±0.1，然后加入0.5 mol·L-1的硫酸锌溶液5 mL，确保充分混合后转入50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度并充分混匀后转入离心管，8 000 r·min-1离心2 min后收集清液过0.45 μm滤膜，滤液待上机测定。

1.2.3 高效液相色谱测定条件

色谱柱Agilent Eclipse XDB–C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：35 ℃；流动相组成：0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-乙腈（95+5）；流速：0.8 mL·min-1；进样量：10 μL；检测波长：200 nm。

1.3 数学模型的建立

试样中泛酸含量的计算公式为

（1）

式中：X为试样中泛酸含量，mg/100 g；C为由标准曲线得到的试样溶液中泛酸的质量浓度，μg·mL-1；m为试样的取样量，g；V为试样测定液总体积，mL；f为加标试验的回收率，%；为换算系数。

2 结果与分析

2.1 不确定度分量的来源分析

本实验不确定度来源主要由标准曲线的拟合、乳制品的称量及其前处理过程、测量重复性和加标试验回收率组成。

2.2 泛酸各标准溶液配制和标准曲线的拟合引入的相对标准不确定度urel（c）

2.2.1 标准储备液配制过程引入的相对标准不确定度urel（c1）

（1）标准品纯度引入的相对标准不确定度urel（B）。泛酸证书显示纯度为98.5%，k=2，扩展不确定度为0.5%，则泛酸标准品纯度引入的相对标准不确定度为

（2）泛酸称量引入的相对标准不确定度urel（m）。称取55.10 mg泛酸标准品，感量为0.01 mg的天平检定证书中示值误差为±0.05 mg，按矩形分布计算，泛酸称量引入的相对标准不确定度为

（3）使用100 mL容量瓶配制泛酸标准储备溶液引入的相对标准不确定度urel（V）。依据《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[10]，100 mL A级容量瓶20 ℃时，容量允差为±0.10 mL，按照均匀分布计算，则体积引入的标准不确定度为实验室温度（20±5）℃，溶剂水的体积膨胀系数为2.1×10-4 ℃-1，按照均匀分布计算，由环境温度引入的标准不确定度为使用100 mL容量瓶配制泛酸标准储备溶液引入的相对标准不确定度为综上，标准储备液配制过程引入的相对标准不确定度为

2.2.2 标准曲线溶液配制过程中引入的相对标准不确定度urel（c2）

标准曲线溶液配制过程中使用到100 mL A级容量瓶、1 mL、2 mL、3 mL、5 mL、15 mL、20 mL和25 mL单标线吸量管[10]。溶剂水的膨胀系数为2.1×10-4 ℃-1，不确定度来源主要由各量器本身和实验室环境温度（20±5）℃组成，详见表1。故该配制过程引入的相对标准不确定度为

2.2.3 标准曲线拟合过程引入的相对标准不确定度urel（c3）

根据表2数据，以泛酸浓度为横坐标，泛酸色谱峰面积平均值为纵坐标，绘制标准曲线方程为A=16.391C-2.439 4，r2=0.999 9。

对乳制品样品连续测定6次，经校准曲线校准得到平均质量浓度C0=15.86 μg·mL-1，拟合过程引入的标准不确定度计算公式为

（2）

（3）

式中：S为泛酸标准溶液峰面积的标准偏差；C0为乳制品样品中泛酸含量，15.86 μg·mL-1；b为标准曲线斜率，b=16.391；a为标准曲线截距，a=2.439 4；p为乳制品样品测定次数，p=6；n为泛酸标准溶液总测定次数，n=12；Ci为泛酸各标准溶液浓度，μg·mL-1；为泛酸标准溶液平均浓度，10.49 μg·mL-1。

经计算得S=1.474 0，u（c3）=0.048 52 μg·mL-1，则泛酸标准曲线拟合过程引入的相对标准不确定度为

综上，泛酸各标准溶液配制引入的不确定度为

2.3 样品的称量及其前处理过程引入的相对标准不确定度urel（S）

2.3.1 乳制品称量引入的相对标准不确定度urel（S1）

称取乳制品样品5 g，天平检定证书中示值误差为±0.5 mg，按照均匀分布计算，乳制品称量引入的相对标准不确定度为

2.3.2 乳制品制备过程引入的相对标准不确定度urel（S2）