蛋白粉中蛋白质含量测定的不确定度评估

作者: 苏君梅 黄玲 黎俊威 林湛皓 谢小浩 刘春丽

蛋白粉中蛋白质含量测定的不确定度评估0

摘 要:应用《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》(GB 5009.5—2016)第一法凯氏定氮法测定蛋白粉中蛋白质的含量,参考《化学分析中不确定度的评估指南》(CNAS-GL006:2019)及《测量不确定度评定与表示》(JJF 1059.1—2012)进行蛋白质测量的不确定度评价。结果表明,蛋白粉中蛋白质的含量为86.90 g/100 g,扩展不确定度为2.64 g/100 g,因此蛋白质含量测定结果报告为(86.90±2.64)g/100 g。影响蛋白粉中蛋白质测定不确定度的主要因素为定氮过程,其次是样品的称量、前处理、测量及盐酸标准溶液滴定浓度。

关键词:蛋白粉;蛋白质;不确定度;凯氏定氮法

Uncertainty Evaluation for Determination of Protein in Protein Powder

SU Junmei, HUANG Ling, LI Junwei, LIN Zhanhao, XIE Xiaohao, LIU Chunli*

(Access (Guangzhou) Testing Technology Service Co., Ltd., Guangzhou 510730, China)

Abstract: The protein content in protein powder is determined using the first method of GB 5009.5—2016 automatic Kjeldahl nitrogen analyzer, with reference to CNAS-GL006:2019 and JJF 1059.1—2012 for protein measurement uncertainty evaluation. The results showed that the protein content in protein powder was determined to be 86.90 g/100 g using the Kjeldahl nitrogen analyzer method, with an expanded uncertainty of 2.64 g/100 g. Therefore, the protein content determination result was reported as (86.90±2.64) g/100 g. The main factor affecting the uncertainty of protein determination in protein powder is the nitrogen determination process, followed by sample weighing, pretreatment, sample measurement, and hydrochloric acid standard solution drop concentration.

Keywords: protein powder; protein; uncertainty; Kjeldahl nitrogen determination method

测量不确定度是评估检测结果质量的重要指标,它反映了检测结果与被测量真实值的接近程度,以及检测数据的可信度[1-4]。《检测和校准实验室能力认可准则》(CNAS-CL001:2018)由中国合格评定国家认可委员会编制,其中明确规定实验室要对测量不确定度进行评估[5-6]。中国合格评定国家认可委员会还发布了《测量不确定度的要求》(CNAS CL01-G003:2021),进一步规范了实验室的不确定度评定过程[7-8]。

蛋白质作为蛋白粉中最主要的营养物质,是判断产品质量是否符合标准的关键依据[9]。当蛋白质含量检测结果接近规定的标准临界值时,基于测量不确定度的符合性声明成为评判产品合规性的重要手段[10]。本文参考《化学分析中不确定度的评估指南》(CNAS-GL006:2019)[11]和《测量不确定度评定与表示》(JJF 1059.1—2012)[12]的规定和要求,对使用自动凯氏定氮仪法测量蛋白粉中蛋白质含量的不确定度进行了分析,评估了不确定度的来源以及各因素对测量不确定度的贡献,并对关键的影响因素进行了深入的讨论与分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛋白粉,市售;无水碳酸钠纯度标准物质,编号GBW(E)060023c,中国计量科学研究院;95%乙醇、硫酸钾、硫酸铜、浓盐酸、浓硫酸、氢氧化钠、硼酸(分析纯),广州化学试剂厂;甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、亚甲基蓝指示剂(分析纯),广州光华科技股份有限公司;水为符合《分析实验室用水规格和试验方法》(GB/T 6682—2008)规定要求的一级水。

1.2 仪器与设备

XS204-分析天平,梅特勒-托利多国际股份有限公司;DIGESTOR消化炉、Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪,FOSS公司。

1.3 方法

依据《食品安全国家标准 食品中蛋白质含量的测定》(GB 5009.5—2016)[13]第一法凯氏定氮法测定蛋白粉中蛋白质的含量。蛋白粉产品的主要营养成分蛋白质经过加热催化被分解,产生的氨气可以与硫酸反应生成硫酸铵,经过碱化蒸馏,将游离出来的氨气用硼酸吸收,最后用盐酸标准溶液滴定,根据盐酸的消耗量来计算产品中蛋白质的含量。

1.3.1 试剂配制

40%氢氧化钠溶液:往烧杯中加入2.5 L水,边搅拌边倒入1 000 g氢氧化钠,冷却后倒入相应储液桶。

1%溴甲酚绿-95%乙醇溶液:称量0.2 g溴甲酚绿指示剂于200 mL棕色容量瓶中,加入约100 mL 95%乙醇,超声至完全溶解后定容。

0.1%甲基红-95%乙醇溶液:称量0.2 g甲基红指示剂于200 mL棕色容量瓶中,加入约100 mL 95%乙醇,超声至完全溶解后定容。

Foss全自动凯氏定氮仪1%硼酸溶液:称量40 g硼酸,加4 L水搅拌溶解后,加入40 mL 0.1%溴甲酚绿-95%乙醇溶液及28 mL 0.1%甲基红-95%乙醇溶液,搅拌均匀后倒入相应储液桶。

1.3.2 标准滴定溶液配制与标定

0.100 0 mol·L-1标准盐酸溶液制备:移取9 mL浓度为36%~38%的浓盐酸于1 000 mL容量瓶,定容摇匀,用基准试剂无水碳酸钠对盐酸浓度进行标定。

称取适量的无水碳酸钠基准试剂,于300 ℃马弗炉中灼烧,灼烧至恒重后置于50 mL水中溶解,滴加10滴溴甲酚绿-甲基红指示液。用配制好的盐酸溶液滴定,当溶液的颜色从绿色变为暗红色后,煮沸溶液,维持2 min,盖上橡胶塞待其冷却。等溶液冷却至室温后继续滴定直到溶液再次呈现暗红色,记录消耗盐酸的体积。为确保结果的准确性,需进行一次空白试验。

1.3.3 蛋白粉蛋白质含量测定

称取0.10~0.15 g(精确到0.001 g)经过充分混匀的蛋白粉样品,置于消化管中,往消化管添加0.8 g硫酸铜、7 g硫酸钾和10 mL硫酸溶液后,置于消化炉中进行消化,设置消化温度为420 ℃,消化时间为1 h,观察到消化管中液体呈绿色透明状时,取出冷却后,放置在自动凯氏定氮仪上(使用前将水、浓度为40%的氢氧化钠溶液、盐酸的标准溶液、甲基红乙醇溶液-溴甲酚绿乙醇溶液混合指示剂的硼酸溶液分别加入自动凯氏定氮仪的不同储液罐中),自动进行加液、蒸馏、滴定等步骤,并记录滴定数据,从而实现对蛋白粉含量的精确测定。

1.3.4 数据处理

盐酸标准滴定溶液浓度的计算公式为

(1)

式中:m为无水碳酸钠的质量,g;V1为盐酸溶液的体积,mL;V2为空白试验中盐酸溶液消耗体积,mL;M为无水碳酸钠的摩尔质量,1/2M(Na2CO3)=52.994 g·mol-1。

蛋白粉中蛋白质含量的计算公式为

(2)

式中:X为蛋白粉中蛋白质含量,g/100 g;V1为试样在滴定过程中消耗的盐酸标准滴定液的体积,mL;V2为试剂空白在滴定过程中消耗的盐酸标准滴定液的体积,mL;c为盐酸标准滴定溶液的浓度,mol·L-1;0.014 0为1.0 mL浓度为1.000 mol·L-1的盐酸标准滴定溶液相当的氮的质量,g;m为试样的质量,g;F为氮折算为蛋白质的系数,对于大豆蛋白制品,折算系数为6.25;100为换算系数。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

依据CNAS-GL006:2019和JJF 1059.1—2012的相关要求,对测量过程和数学模型进行深入分析,得到蛋白粉测定过程中不确定度的主要来源:试样测量过程中重复性产生的不确定度u()、盐酸标准滴定溶液浓度引入的不确定度u(C)、试样称量过程中产生的不确定度u(m)、试样前处理环节产生的不确定度u(x2)、试样定氮环节产生的不确定度u(x3)。

2.2 不确定度分量评估

2.2.1 试样测量重复性产生的不确定度

在评估测量重复性产生的不确定度时,要考虑操作人员和仪器设备稳定性对不确定度的影响。采用同一样品进行重复实验,蛋白粉中蛋白质含量的测定结果见表1。

同一人员、相同设备重复测定蛋白粉中蛋白质含量的标准不确定度和相对标准不确定度分别为

2.2.2 盐酸标准滴定溶液浓度引入的不确定度

盐酸标准滴定溶液浓度引入的不确定度包括盐酸标准滴定溶液浓度测量重复性产生的不确定度u(CHC1)、工作基准试剂无水碳酸钠本身产生的不确定度u(CRS)、工作基准试剂无水碳酸钠称量产生的不确定度u(mRS)以及盐酸标准滴定溶液滴定过程产生的不确定度u(V)。

(1)盐酸标准滴定溶液浓度测量重复性产生的不确定度。盐酸标准滴定溶液浓度测定的重复实验结果如表2所示。

盐酸标准滴定溶液第1次滴定浓度测量重复性产生的标准不确定度和相对标准不确定度分别为

盐酸标准滴定溶液第2次滴定浓度测量重复性产生的标准不确定度和相对标准不确定度分别为

2次测量盐酸标准滴定溶液浓度时,重复性产生的相对标准不确定度为

(2)工作基准试剂无水碳酸钠本身产生的不确定度。工作基准试剂无水碳酸钠本身产生的不确定度从含量和摩尔质量两方面考虑。基准试剂无水碳酸钠的含量为99.95%~100.05%,最大允许误差为0.05%,干燥过程按国标要求,于300 ℃高温炉中灼烧至恒重,得到基准试剂无水碳酸钠的含量P为99.98%,认定为无其他不确定度来源。取矩形分布,则基准试剂无水碳酸钠含量引入的标准不确定度和相对标准不确定度分别为

依据国际纯粹与应用化学联合会(International Union of Pure and Applied Chemistry,IUPAC)现行有效的原子量表,可知碳酸钠(Na2CO3)各组成元素的原子量以及相对应元素的不确定度,如表3所示。对于每一个元素而言,标准不确定度是将IUPAC给出的不确定度作为矩形分布的边界计算得出,因此对应的标准不确定度等于查得数值除以。

通过表3数据,可以计算出碳酸钠的摩尔质量,即M(Na2CO3)=105.99 g·mol-1。同时,将各元素的原子量、标准不确定度数值与其对应的原子数相乘,得到Na2CO3中各元素对摩尔质量的贡献以及相对应的不确定度分量,如表4所示。

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