基因编辑技术在食源性微生物检测中的应用研究进展

摘 要：食源性微生物污染严重威胁人类健康，而传统检测方法如培养法、生化检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法存在一定局限性。近年来，基因编辑技术的快速发展为食源性微生物检测带来了新机遇。与传统方法相比，基因编辑技术在灵敏度、特异性和检测速度上表现出优势，可检测低拷贝数的目标核酸、精准识别目标微生物且耗时短。本文综述了食源性微生物的传统检测方法、新型基因编辑技术及其应用前景。

关键词：基因编辑技术；食源性微生物；食品安全

Research Progress on the Application of Gene Editing Technologies in the Detection of Foodborne Microorganisms

Abstract： Foodborne microbial contamination poses a serious threat to human health， and traditional detection methods such as culture methods， biochemical detection methods， immunological detection methods， and molecular biological detection methods have certain limitations. In recent years， with the rapid development of gene editing technology， new opportunities have emerged for the detection of foodborne microorganisms. Compared with traditional methods， gene editing technology has advantages in sensitivity， specificity， and detection speed， capable of detecting low copy number target nucleic acids， accurately identifying target microorganisms， and being time-efficient. This article mainly reviews the traditional detection methods for foodborne microorganisms， new gene editing technologies， and their application prospects.

Keywords： gene editing technology; foodborne microorganisms; food safety

食源性微生物污染是全球公共卫生面临的重大挑战之一，可引起食物中毒、肠道感染等多种疾病，严重威胁人类健康。食源性致病因子包括细菌、病毒、真菌、寄生虫、立克次体和产毒藻类等，其中细菌是主要的危害因素。常见的食源性细菌包括沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌、弯曲杆菌、弧菌、耶尔森氏菌和志贺氏菌等，主要存在于肉类、禽类、海鲜、蛋类和蔬菜等多种食品中[1]。据世界卫生组织统计，全球每年因食用受污染食品而患病的人数众多。因此，快速、准确地检测食源性微生物对于保障食品安全至关重要。虽然传统的检测方法在食源性微生物检测中发挥了重要作用，但随着科技的发展，其局限性日益凸显。近年来，基因编辑技术的出现为食源性微生物检测带来了新的机遇和突破[2]。

1 传统检测方法

1.1 培养法

培养法是通过将样品接种到特定的培养基上，在适宜的温度、湿度和气体条件下培养一定时间，观察微生物的生长情况，从而对微生物进行鉴定和计数。此方法主要基于不同微生物对营养物质、温度、pH值、氧气等生长条件有不同的要求，通过利用这些微生物的生长特性差异，选择性地培养和检测目标微生物。培养法可以直接观察微生物的生长情况，并可进一步开展生化和药敏试验等分析。然而，该方法检测周期较长，尤其是对于一些生长缓慢的微生物（如结核分枝杆菌），可能需要数周甚至数月才能得到检测结果。

1.2 生化检测法

生化检测法是通过检测微生物在代谢过程中产生的特定生化反应来鉴定微生物，主要基于细菌在代谢糖类时会使培养基pH值下降，通过加入酸碱指示剂（如溴甲酚紫）并根据颜色变化差异进行检测。该方法需要先对微生物进行培养，因此仍然存在检测周期较长的问题。此外，生化反应可能受到多种因素的影响，如培养基成分、培养条件等，可能导致结果出现假阳性或假阴性。

1.3 免疫学检测法

免疫学检测法是利用抗原与抗体的特异性结合来检测食源性微生物。常见的免疫学检测方法包括酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、免疫荧光技术、乳胶凝集试验等。目前，常用的免疫学检测法主要是ELISA，该方法是将已知的抗体或抗原固定在固相载体表面，加入待检测样品，若样品中含有相应的抗原或抗体，则会与固相上的抗体或抗原结合，然后加入酶标记的第二抗体或抗原，通过酶催化底物显色反应来检测抗原-抗体复合物的存在。免疫学检测法具有较高的特异性和灵敏度，可以快速检测出微量的微生物抗原或抗体。然而，该方法需要高质量的抗体，且抗体的制备过程复杂且成本较高。此外，某些微生物可能存在抗原变异的情况，导致检测结果不准确。

1.4 分子生物学检测法

分子生物学检测法是通过直接检测微生物的核酸（DNA或RNA）来鉴定微生物。常见的方法包括聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）及其衍生技术（如实时荧光定量PCR、多重PCR等）[3]。PCR是一种体外扩增DNA的技术，以目标DNA为模板，在耐热DNA聚合酶、引物、dNTP等存在的条件下，通过高温变性、低温退火、中温延伸3个步骤的循环，使目标DNA大量扩增。实时荧光定量PCR则是在PCR的基础上引入荧光标记物，实时监测PCR反应过程中产物的积累量，从而实现对目标基因的定量分析。分子生物学检测法具有极高的灵敏度，可以检测到极少量的微生物核酸，从而能够快速检测到微生物。然而，该方法对仪器设备和实验环境要求较高，操作需要专业人员，并且容易受到污染，导致假阳性结果。此外，一些复杂的样品，如含有大量杂质或抑制物的食品样品，可能会干扰核酸的提取和检测。

2 基因编辑技术

基因编辑技术是一类能够在基因组水平上修改DNA序列的技术。近年来，基因编辑技术得到飞速发展，推广应用到了生物、医学、农业以及食品安全等领域，在疾病筛查、动植物改造及病原微生物检测等领域发挥着巨大的作用。主要的基因编辑工具包括锌指核酸酶（Zinc-Finger Nucleases，ZFNs）、转录激活因子样效应因子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALENs）和成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Protein 9，CRISPR/Cas9）。目前，基因编辑技术已广泛应用于疾病筛查、癌症基因监测和食源性致病菌检测等领域[4]。

2.1 ZFNs在食源性微生物检测中的应用

ZFNs由锌指蛋白结构域和核酸内切酶Fok Ⅰ结构域组成。锌指蛋白结构域可以识别特定的DNA序列，通过设计不同的锌指蛋白组合，可以特异性地识别并结合目标DNA序列。核酸内切酶结构域则具有切割DNA的功能，当锌指蛋白与目标DNA结合后，核酸内切酶在特定位置切割DNA双链，使得双链断裂（Double-Strand Break，DSB）[5]。对于病原微生物检测，可设计ZFNs识别病原微生物基因组中的保守序列，当病原微生物核酸存在于样本中时，ZFNs与之结合并切割，随后可通过检测切割产物或相关的信号变化来确定病原体的存在。与传统的病原体培养和检测方法相比，基于ZFNs的检测方法可以直接对食源性微生物核酸进行操作，能在较短时间内得到检测结果。此外，该方法可精准识别食源性微生物的特异基因，有效区分不同种类的微生物，避免因其他微生物或宿主核酸的干扰而出现假阳性，有助于及时、高效、精确诊断。

2.2 TALENs在食源性微生物检测中的应用

TALENs是一种可对特定DNA序列进行编辑的工具，由转录激活因子样效应物（Transcription Activator-Like Effector，TALE）和核酸内切酶Fok Ⅰ组成。TALE依据目标基因的序列进行设计，其氨基酸序列与目标DNA碱基之间存在特定的对应关系，能够精确地识别目标基因的特定序列，Fok Ⅰ则在识别位点发挥切割作用[6]。对于食源性微生物检测，可针对微生物的毒力基因、耐药基因或标志性基因等特定基因设计TALENs。当TALENs识别并结合到目标微生物的特定DNA序列后，Fok Ⅰ发挥切割作用。在切割反应发生时，通过检测荧光信号的变化来确定目标微生物的存在。TALENs能够高度特异性地识别目标食源性微生物的基因序列，这一特性使得其在复杂的食品样本中能够准确区分目标微生物与其他微生物或食品成分中的非靶DNA，从而有效降低假阳性率。此外，TALENs可以检测到较低水平的目标微生物。即使微生物含量较低且处于初始污染阶段，TALENs也能检测到其特定基因的存在，有助于尽早发现食品微生物污染问题，保障食品安全。

2.3 CRISPR/Cas9在食源性微生物检测中的应用

CRISPR-Cas系统是一种来源于细菌和古细菌的适应性免疫系统，该系统由单导向RNA（single-guide RNA，sgRNA）、Cas相关蛋白两部分组成。sgRNA能够特异性地识别目标DNA序列；Cas相关蛋白能够在sgRNA的引导下切割目标DNA序列。通过设计特定的sgRNA，CRISPR/Cas系统能够精确地识别并切割目标微生物的DNA序列，并结合荧光报告基因或其他检测方法来确认目标微生物的存在，从而实现对目标微生物的检测[7]。操作步骤主要包括设计并合成特异性的sgRNA，使其能够识别目标微生物的DNA序列；表达Cas相关蛋白，可以是天然的Cas相关蛋白，也可以是经过改造的Cas相关蛋白，如dCas12，以提高系统的特异性和安全性；将sgRNA和Cas蛋白引入样品中，使其与目标微生物的DNA序列结合并切割。CRISPR-Cas系统在检测食源性微生物时具有极高的灵敏度，可以检测到低至几个拷贝数的目标核酸。

3 基因编辑技术的应用前景与挑战

3.1 应用前景

随着基因编辑技术的不断发展与成熟，有望开发出基于基因编辑技术的即时检测（Point-of-Care Testing，POCT）设备，实现食源性微生物的现场快速检测。例如，可开发基于CRISPR-Cas系统的试纸条检测方法，将基因编辑反应与可视化检测相结合，可以在短时间内得到检测结果，适用于食品加工现场、农贸市场等场所的快速检测。此外，通过设计多种特异性的基因编辑工具，可以实现对多种食源性微生物的同时、及时、快速检测。例如，利用多重CRISPR-Cas系统，实现在一个反应体系中检测多种常见的食源性致病菌，提高检测效率，减少检测时间和成本。

3.2 面临的挑战

目前，基因编辑技术在实际应用中仍存在脱靶效应的问题，即编辑工具可能会错误地切割非目标DNA序列。在食源性微生物检测中，脱靶效应可能会引起假阳性结果，影响检测的准确性。这就需要进一步改进基因编辑技术，提高其特异性，降低脱靶风险。此外，现阶段基因编辑技术在食源性微生物检测中的应用还缺乏统一的标准和规范。不同实验室采用的基因编辑方法和检测流程可能存在差异，导致检测结果的可比性较差。因此，需要制定相关的标准和指南，确保基因编辑技术在食源性微生物检测应用中的可靠性和稳定性。

4 结语

基因编辑技术为食源性微生物检测带来了新的思路和方法，在灵敏度、特异性和检测速度等方面具有明显优势。然而，其在应用过程中也面临着脱靶效应和技术标准化等挑战。随着技术的不断发展和完善，基因编辑技术有望在食源性微生物检测领域发挥更重要的作用，为保障食品安全提供更有力的支持。

参考文献

[1]ABEBE E，GUGSA G，AHMED M.Review on major food-borne zoonotic bacterial pathogens[J].J Trop Med，2020：4674235.

[2]VIDYADHARANI G，VIJAYA BHAVADHARANI H K，SATHISHNATH P，et al.Present and pioneer methods of early detection of food borne pathogens[J].J Food Sci Technol，2022，59（6）：2087-2107.

[3]张德福，高乐，张明，等.分子生物学技术在食源性致病菌快速检测中的研究进展[J].食品工业科技，2024，45（13）：368-377.

[4]贺飞燕，闫建俊，冯瑞云，等.基因组编辑技术的原理及应用[J].应用与环境色生物学报，2016，22（2）：350-356.

[5]李万利，李文清，王明发.锌指核酸酶及其应用研究进展[J].河南农业科学，2014，43（8）：1-9.

[6]张金脉，任兆瑞.TALENs：一种新的基因定点修饰技术[J].生命科学，2013，25（12）：126-132.

[7]王亮，宋毅，苗立中，等.CRISPR-Cas12a在病原检测中的应用进展[J].山东畜牧兽医，2023，44（9）：90-94.