HPLC-ICP-MS在食品硒形态分析中的应用研究

作者: 祁蒙 宋仕勤 许亚丽 王淇 夏曾润 赵欣

摘 要:富硒食品的开发为人们补硒提供了有效途径,而准确测定食品中硒形态及其含量是评价富硒食品生物功能和安全性的关键。本文系统阐述高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry,HPLC-ICP-MS)应用于食品硒形态分析中的研究进展,以期为开发高效、便捷、推广性强的硒形态分析方法提供参考。

关键词:食品;硒形态;高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)

Research on the the Application of HPLC-ICP-MS in the Morphological Analysis of Selenium in Food

Abstract: The development of selenium-enrich foods provides an effective way for people to supplement selenium, and the accurate determination of selenium form and content in food is the key to evaluate the biological function and safety of selenium-rich foods. In this paper, the research progress of the application of high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry (HPLC-ICP-MS) in the morphological analysis of selenium in food is systematically reviewed, in order to provide reference for the development of an efficient, convenient and widely used method for selenium morphology analysis.

Keywords: food; form of selenium; high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry (HPLC-ICP-MS)

硒是人和动物生命活动中必需的微量元素,是谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶等的活性成分,在调节机体免疫力、清除自由基、防癌抗癌、保护肝脏等方面发挥着重要作用[1]。人体长期硒摄入不足会导致机体免疫力下降,诱发克山病、大骨节病、癌症和糖尿病等多种疾病[2]。中国营养学会推荐正常成人的硒摄入量为60~250 μg·d-1[3]。然而,我国居民人均硒摄入量不足40 μg·d-1[4]。富硒食品的开发为人们补硒提供了便捷有效的途径。硒在食品中分为无机硒和有机硒两类,无机硒包括硒酸根、亚硒酸根和单质硒,有机硒包括硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代乙硫氨酸和硒脲等小分子硒化物以及硒蛋白、硒多糖等。有机硒生物活性高、安全无毒,是人体补充硒的主要来源。因此,全面、准确分析食品中硒的赋存形态,对于富硒食品的开发和人们科学补硒具有重要意义。

1 食品中硒形态的测定

硒的赋存形态及其含量在很大程度上决定着富硒食品的营养价值和安全性。食品基质复杂,硒形态种类多样且总体上含量较低,而且不同硒形态之间极易发生转化,导致食品中硒形态的分析具有一定挑战性,至今尚未形成同时测定食品中多种硒形态的国家标准。

食品中硒形态的检测分析主要包括待测样品中硒化合物的提取、不同硒形态的分离富集以及各组分的定性定量检测等环节。色谱分离与光谱/质谱检测技术联用,已成为硒形态研究的常用手段,如高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry,HPLC-ICP-MS)联用技术、高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱(High Performance Liquid Chromatography-Hydride Generation-Atomic Fluorescence Spectrometry,HPLC-HG-AFS)联用技术等[5]。其中,HPLC-ICP-MS检出限较低、分离能力较好以及灵敏度较高,是现阶段硒形态分析中应用最广泛的方法。例如,梁志森等[6]采用HPLC-ICP-MS测定植物性富硒食品中硒酸根、亚硒酸根、硒代胱氨酸、L-硒甲基硒代半胱氨酸、L-硒代蛋氨酸、甲基亚硒酸及硒代乙硫氨酸7种硒形态的含量;孟莉等[7]采用HPLC-ICP-MS研究谷类食品中硒代胱氨酸、亚硒酸根、硒代蛋氨酸和硒酸根4种硒形态;李乾玉[8]采用HPLC-ICP-MS研究畜肉中硒酸根、亚硒酸根、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸5种硒形态。

2 食品中硒形态提取方法研究

采用高效的前处理方法提取食品中与大分子物质结合的硒,是硒形态定量分析的前提。常用的提取方法有水提法、缓冲盐(Tris-HCl)提取法、酸提法、碱提法和酶提法。其中,酶提法因反应条件温和、硒化合物的结构不易被破坏,在食品中硒形态的提取方面应用最为广泛[9-11]。采用酶提法时,需要优化酶的种类、用量、酶解时间、溶液pH值等条件。常用于硒形态提取的酶主要有蛋白酶XIV、蛋白酶K、胰蛋白酶、纤维素酶等,多种酶混合使用已成为硒形态提取的一种趋势[12]。为兼顾硒形态的提取效率和稳定性,提取时间大多都控制在3 h以内[13]。另外,超声、微波等常用的辅助提取技术,在提高硒形态提取率、缩短提取时间方面有积极的作用[9]。

3 HPLC-ICP-MS应用于硒形态检测的研究

仪器条件(色谱条件和ICP-MS工作条件)决定了所建立方法的精密度、准确性和检测效率。因此,采用HPLC-ICP-MS测定硒形态时,需要综合考虑色谱条件和ICP-MS工作条件的优化。

3.1 色谱条件的优化

采用HPLC-ICP-MS对硒元素形态进行分析时,色谱条件的优化主要涉及色谱柱的选择、流动相的组成及浓度、洗脱方式、流动相流速等方面。

3.1.1 色谱柱的选择

常用的色谱柱主要分为阴离子交换色谱柱和反相色谱柱。Hamilton PRP-X100阴离子交换色谱柱能够有效分离5种硒形态,特别适用于无机硒和小分子硒代氨基酸的分离,分离度较好,峰形对称,是目前硒形态分析最常用的色谱柱。但通常使用该色谱柱时个别硒形态出峰时间较长,灵敏度低,色谱柱的使用寿命易受到影响[14]。反相色谱柱可分离的硒形态种类更多,且分析时间短、峰形尖锐、灵敏度高,对大分子有机硒化合物分离效果较好,其在硒形态分析中的应用日益受到关注[15-16]。常用的反相色谱柱有安捷伦ZORBAX SB-Aq C18柱、Athena C18柱、Hypersil GOLD C8柱等,其中以ZORBAX SB-Aq C18柱应用最为广泛。卢鑫等[9]比较了Hamilton PRP-X100柱和C18色谱柱对5种硒代氨基酸的分离能力,结果显示C18色谱柱能够完全分离5种硒代氨基酸,且峰形较好。陆奕娜等[17]对比了Hamilton PRP-X100阴离子分析柱、安捷伦ZORBAX SB-Aq C18柱、安捷伦TC-C18柱等6种色谱柱对硒形态的分离效果,结果显示Hamilton PRP-X100柱能分离出5种硒形态,安捷伦ZORBAX SB-Aq C18柱能有效分离出7种硒形态,其他4种色谱柱均出现色谱峰重叠的现象。

3.1.2 流动相的选择

采用Hamilton PRP-X100阴离子柱进行硒形态分离时,流动相常选择磷酸盐或柠檬酸。柠檬酸能够增加色谱柱与硒化合物之间的作用力,从而增强分离效果、降低检出限[18]。磷酸盐具有较好的缓冲效果,能够改善峰形、提高定量分析的准确性。采用反相色谱柱进行硒形态分离时,所用流动相主体为高水相,同时会加入缓冲液、离子对试剂和少量的极性有机溶剂,以改善不同硒形态的分离效果。常用的离子对试剂有烷基磺酸盐类、四丁基铵盐类和七氟丁酸等全氟羧酸类。少量的甲醇等有机溶剂能够提高流动相的洗脱能力,增强检测器的信号强度。现有研究中流动相以柠檬酸+己烷磺酸钠+甲醇、磷酸氢二铵+四丁基溴化铵+甲醇两种组合最为常见[13,19]。张珂等[20]以ZORBAX SB -Aq C18柱为分离色谱柱,以加入己烷磺酸钠的柠檬酸体系为流动相,发现所测硒形态可以在8 min内有效分离,且各硒形态具有较高的灵敏度。王贤波等[11]研究发现,在磷酸氢二铵体系中加入0%~2.0%的甲醇能够明显增加硒形态的信号强度,且信号强度随着甲醇浓度的升高而增大。

3.1.3 流动相的浓度

流动相的浓度与色谱分离效果和保留时间密切相关。流动相浓度越大,保留时间越短;但流动相浓度过大时,会导致硒形态分离不彻底,色谱峰重叠。卢鑫等[9]研究发现,当磷酸氢二铵溶液(pH值为6.5)为25 mmol·L-1时,5种硒代氨基酸分离效果较好且分析时间较短。姚真真等[21]研究发现,当柠檬酸浓度为5 mmol·L-1时,5种硒形态在15 min内能够较好地分离;增加柠檬酸浓度,保留时间缩短,但峰形有重叠和拖尾现象。

3.1.4 流动相pH值

流动相的pH值对色谱峰的峰形、检测灵敏度、保留时间影响较大。流动相的pH值不仅决定着硒在流动相中的不同离子形态,还会影响柠檬酸的质子化反应,改变不同形态硒与流动相之间的相互作用。李乾玉等[8]研究发现,以10 mmol·L-1柠檬酸及5 mmol·L-1己烷磺酸钠(含1%甲醇)为流动相,在pH值为4.0时分离畜肉中的5种硒形态效果较好。李倩等[10]以25 mmol·L-1的柠檬酸为流动相,对比不同pH值对硒形态的分离效果,发现pH值为6.0时各硒形态分离度最好。

3.1.5 流动相流速

流动相的流速主要影响出峰时间和峰形。流速较小时,洗脱能力较弱,出峰延迟,峰形较宽;流速越大,峰形越窄,出峰时间越短。但流速过快会导致色谱峰重叠,常用的流速为0.8~1.2 mL·min-1。魏琴芳等[13]研究发现,30 mmol·L-1磷酸氢二铵(pH值为6.0)在流速为1.0 mL·min-1时,对大豆中5种硒形态的分离效果较好。陈思伊等[18]研究发现,流动相流速为1.0 mL·min-1时,色谱柱呈现出最佳的柱效,其对食品中5种硒形态的分离效果最优。

3.1.6 洗脱方式

不同的洗脱方式对硒形态的分析时间和分离效果都有影响。等度洗脱在硒形态分离中最为常见,但通常保留时间较长;梯度洗脱能有效缩短分析时间,在硒形态研究中的应用越来越受重视。陈贵宇等[16]以含5%的10 mmol·L-1柠檬酸的水溶液为流动相分离茶叶中的5种硒形态,采用等度洗脱时5种硒化合物的分离时间达到22 min,而梯度洗脱能够将分离时间缩短至15 min内。陈思伊等[18]以不同浓度的磷酸氢二铵体系进行梯度洗脱,使5种硒形态的分析时间由原来的16.0 min左右缩短至8.5 min左右。

3.2 ICP-MS工作条件的优化

ICP-MS工作条件包括高频入射功率、载气流量、等离子体气流量、检测同位素、碰撞模式及蠕动泵转速等。其中,检测同位素数和碰撞模式的优化在现有研究中有报道,其他指标主要依靠ICP-MS调谐和优化来实现。

3.2.1 检测同位素

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