一起鼠伤寒沙门菌单相变异株引起的食源性疾病事件病原学分析

摘 要：目的：对一起食源性疾病事件进行溯源调查和病原学分析。方法：结合流行病学调查结果共采集24份可疑食品及器具涂抹样本和17份患者粪便样本。对粪便样本采用Realtime PCR方法筛查病原，并开展流调样本的分离培养。对分离株进行血清学鉴定、PFGE分子分型、药敏试验和全基因组测序，根据全基因组测序数据预测分离株血清型、ST型别、耐药基因及毒力基因携带情况。结果：Realtime PCR结果提示粪便样本沙门菌基因检测阳性，流调样本分离培养得到7株沙门菌，均来源于患者粪便，经多种血清分型试验证实为鼠伤寒沙门菌单相变异株I4，[5]，12：i：-。PFGE分子分型试验显示7株沙门菌带型完全一致。基于WGS测序数据预测引起该事件的致病菌为ST34型鼠伤寒沙门菌单相变异株；该分离株对氨苄西林、四环素、链霉素、多西环素及米诺环素耐药，携带aac（6’）-Iaa、aph（6）-Id、aph（3’’）-Ib、blaTEM-1B、sul2及tet（B）6个耐药基因；共注释110个毒力基因，其中101个毒力基因与沙门菌属致病阶段中的附着、侵袭和巨噬细胞内存活相关，未比对出与系统传播有关毒力基因。结论：本次食源性疾病事件是由鼠伤寒沙门菌单相变异株I4，[5]，12：i：-感染引起，全基因组测序技术为食源性疾病事件的处理提供了更多的病原学信息。

关键词：鼠伤寒沙门菌单相变异株；脉冲场凝胶电泳；食源性疾病；全基因组测序

Abstract： Objective： To investigate the source of a food-borne disease and analyze its etiology. Method： A total of 24 smeared samples of suspicious food and utensils， 17 stool samples were collected. Realtime PCR was used to screen the pathogens in stool samples， and isolation and culture of flow cytometry samples were carried out. Serological identification of the isolates， PFGE molecular typing， susceptibility testing and whole genome sequencing， the whole genome sequencing data were used to predict serotypes， ST types， resistance genes and virulence genes of the isolates. Result： The results of Realtime PCR indicated that the gene of salmonella was positive in fecal samples， and 7 strains of salmonella were isolated from flow sample， all of which came from patients’ feces. By a variety of serotyping tests， it was confirmed to be a Salmonella typhimurium Monophasic Variant strain I4，[5]，12：I：-. PFGE molecular typing test showed that 7 strains of salmonella had the same pattern. Based on WGS sequencing data， a single-phase variant of ST34 Salmonella typhimurium Monophasic Variant strain. resistant to ampicillin， tetracycline， streptomycin， doxycycline and Minocycline was identified. The isolate was resistant to ampicillin， tetracycline， streptomycin， doxycycline and minocycline. It carried six resistant genes， aac（6’）-Iaa、aph（6）-Id、aph（3’’）-Ib、blaTEM-1B、sul2 and tet（B）; A total of 110 virulence genes were annotated， of which 101 were associated with attachment， invasion and macrophage survival in the pathogenic stage of salmonella. No virulence genes related to systemic transmission were identified. Conclusion： This food-borne disease event was caused by a Salmonella typhimurium Monophasic Variant strain I4，[5]，12：I：-infection， and whole genome sequencing technology provides additional information on the etiology of food-borne disease events.

Keywords： Salmonella typhimurium monophasic variant; pulsed field gel electrophoresis; food-borne diseases; whole genome sequencing

沙门菌是导致人类和动物胃肠炎和腹泻的最常见病原体之一，其中鼠伤寒沙门菌（S.typhimurium）在全球沙门氏菌感染中占很大比例[1]。鼠伤寒沙门菌单相变异株由于编码基因（如fljA、fljB或hin）的缺失，导致沙门菌第二相鞭毛蛋白表达方面产生缺陷[2]。近年来，欧洲、美国和亚洲的临床分离株中，鼠伤寒沙门菌单相变异株I4，[5]，12：i：-大幅增加，其流行趋势已成为全球公众关注的问题[3]。

2020年4月，山东省临沂市某机构发生一起食源性疾病暴发事件，患者主要表现为发热、腹泻并伴有恶心、呕吐、腹痛等症状。由于该机构相对封闭，患者有明确的共同就餐史，结合临床表现及血常规检测结果，判断为细菌性食源性疾病事件，随后采集可疑样本至实验室进行检测。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

采集样本包括患者粪便17份，食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子24份。

沙门菌诊断血清（丹麦SSI）；XbaＩ限制性内切酶（大连TaKaRa）；革兰氏阴性菌药敏检测板（上海复星）；沙门菌血清型分子鉴定试剂盒（山东美正）；标准菌株H9812及ATCC25922均来自山东省疾控中心。

荧光PCR扩增仪（美国赛默飞）；全自动微生物分析系统VITEK2（法国梅里埃公司）；CHEF-MAPPER脉冲场凝胶电泳仪及成像系统和全自动凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 荧光定量PCR检测

使用商品化试剂盒应用Realtime PCR法对采集到的粪便样本进行沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌和致泻大肠埃希氏菌的多病原检测。

1.2.2 致病菌的分离及鉴定

粪便样本参照《感染性腹泻诊断标准》（WS 271—2007）进行分离培养，食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子样本按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）要求进行检测。

1.2.3 菌株血清型鉴定

使用沙门菌血清型分子鉴定试剂盒和沙门菌诊断血清鉴定分离株血清型。

1.2.4 药敏试验

采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC），按照商品化药敏检测板说明书进行具体操作和结果判读，使用标准菌株ATCC25922作为质控对照。

1.2.5 脉冲场凝胶电泳分型

参照国家致病菌识别网沙门菌PFGE分子分型方法，以H9812为标准Marker。限制性内切酶XbaI进行酶切，经电泳、染色，获得图谱，上传至国家致病菌识别网平台进行聚类分析。

1.2.6 全基因组测序分析

使用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction KitVer.3.0试剂盒提取分离株核酸后，送诺禾致源生物信息科技有限公司进行全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）。测序数据采用Center for Genomic Epidemiology（http：//www.genomicepidemiology.org/）在线分析工具，预测沙门菌血清型[4]、ST型别[5]、耐药表型及耐药基因[6]，基于VFDB（Virulence Factor Database）数据库[7]对沙门菌分离株毒力基因进行注释分析。

2 结果与分析

2.1 荧光定量PCR鉴定结果

结果显示11份患者粪便沙门菌基因检测阳性，食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子样本检测结果均为阴性。

2.2 分离鉴定及血清分型结果

41份流调样本共分离沙门菌7株，编号分别为SDLY20Sal001、SDLY20Sal002、SDLY20Sal003、SDLY20Sal004、SDLY20Sal005、SDLY20Sal007和SDLY20Sal011，均来自患者粪便样本。食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子样本增菌培养后，沙门菌检测结果均为阴性。分离株经沙门菌血清型分子鉴定试剂盒鉴定为鼠伤寒沙门菌，诊断血清凝集结果为4，12：i：-，WGS测序数据预测血清型为I4，[5]，12：i：-，其ST型为34。

2.3 脉冲场凝胶电泳（PFGE）结果

7株分离株的PFGE带型一致，判断此次事件中患者感染同一鼠伤寒沙门菌，该分离株与临沂市2019年收集的两簇鼠伤寒沙门菌相似度只有47.56%和35.33%（图1）。

2.4 药物敏感试验及WGS耐药基因分析结果

药物敏感试验结果显示，本案例沙门分离株对氨苄西林、四环素、链霉素、多西环素及米诺环素耐药，ResFinder4.0预测分离株携带6个耐药基因，分别是氨基糖苷类耐药基因[aac（6’）-Iaa、aph（6）-Id、aph（3’’）-Ib]、β-内酰胺类耐药基因（blaTEM-1B）、磺胺类耐药基因（sul2）及四环素类耐药基因tet（B）。阿米卡星、氨苄西林-克拉维酸钾及磺胺甲恶唑3种抗生素药敏试验与WGS耐药表型预测不同（表1）。

2.5 毒力基因分析结果

基于VFDB数据库分析本案例分离株WGS测序数据共注释110个毒力基因，其中101个毒力基因可根据文献中描述的沙门菌属致病的4个关键阶段[8]进行分类（表2）。与附着相关毒力因子有bcf、csg、fim、lpf、shd、mis，与侵袭/细胞内存活相关毒力因子有inv、org、pip、prg、sic、sif、sip、ssp、slr、sod、sop、sig、spa、spt，与巨噬细胞内存活相关毒力因子有mgt、spi、ssa、ssc、sse、srf，未比对出与系统传播相关毒力因子，前3个阶段对应毒力基因数量分别是26、40及35。