牛奶中黄曲霉毒素M族检测能力验证及创建二级全扫描质谱图

摘 要：目的：验证本检验结构是否有能力按照《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定》（GB 5009.24—2016）中第一法开展牛奶中黄曲霉毒素M1、M2的检验。方法：使用超高效液相色谱串联质谱法进行分析检测，通过验证该方法的线性范围、定量限、正确度和精密度等指标，然后建立液相色谱四极杆串联离子阱复合质谱法，采用多反应监测-信息关联-增强子离子扫描模式（MRM-IDA-EPI），创建黄曲霉毒素M1、M2的二级全扫描质谱图。结果：黄曲霉毒素M1、M2在0.015～0.500 μg·kg-1有良好的线性，相关系数在0.995以上，方法定量限满足标准要求，平均回收率在97.0%～108.0%、相对标准偏差≤20%。结论：本实验室具备开展牛奶中黄曲霉毒素M1、M2检测的能力，同时应用离子阱复合质谱特有的MRM-IDA-EPI扫描模式，可实现对牛奶中黄曲霉毒素M1、M2的筛查、确证。

关键词：超高效液相色谱串联质谱法；同位素内标；黄曲霉毒素M1；黄曲霉毒素M2；方法验证；二级质谱图

Abstract： Objective： To verify the ability of this inspection structure to comply with GB 5009.24—2016 First method for testing aflatoxin M1 and M2 in milk. Method： High performance liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry for analysis， the method was verified by examining the linear range， method quantitative limit， correctness and precision. Then the method of ultra performance liquid chromatography-Q-trap-tandem mass spectrometry （UPLC-Q-Trap-MS） was established by MRM-TDA-EPI scanning mode ，to get second-order full-scan mass spectra. Result： Aflatoxin M1 and M2 had a good linear relationship in the range of 0.015～0.500 μg·kg-1， the correlation coefficient was above 0.995， the quantification limit of the method met the requirements， the average recovery rate was 97.0%～108.0%， and the relative standard deviation was less than or equal to 20%. Conclusion： The laboratory has the ability to carry out the determination of in milk. The MRM-IDA-EPI scanning mode of liquid chromatography quadrupole tandem ion trap composite mass spectrometry was used to realize the screening and confirmation of suspicious peaks.

Keywords： high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; isotopic internal standard; aflatoxin M1; aflatoxin M2; method validation; second-order mass spectra

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）属于双呋喃环类毒素，是一种次级代谢产物，由黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生，约有20种衍生物，会对人和动物造成严重危害[1]。饲料受到黄曲霉毒素B1、B2污染，被动物食用，会代谢产生黄曲霉毒素M1、M2[2]，这些代谢产物会存在于乳、蛋、尿和肉中，最常见的是乳及乳制品中[3]。《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中规定，乳制品中黄曲霉毒素M1的限量不得超过0.5 μg·kg-1，目前关于奶及奶制品中对黄曲霉毒素B1和M1的研究较多[4-6]，而对黄曲霉毒素M1、M2同时检测的研究较少。同时由于食品基质的复杂性，基质效应可能会导致假阳性的发生，而离子阱串联质谱法能获得目标离子的二级质谱图，可以对目标化合物进一步定性[7]。目前使用该模式同时检测牛奶中黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M2的研究较少。本研究主要对GB 5009.24—2016第一法进行验证，确保本检验机构能对牛奶中AFTM1和AFTM2进行准确检测。同时利用仪器自带的离子阱功能（Q-Trap），建立黄曲霉毒素M1、M2的二级全扫描质谱图，对样品中是否含有目标物质进行进一步定性、确认。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

所用牛奶样品（预包装）均为江苏省常州市金坛区市售；甲醇、乙腈（色谱纯，德国默克公司）；乙酸铵（色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司）；氯化钠、十二水和磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钾（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）；盐酸（分析纯，天津科密欧试剂公司）；黄曲霉毒素M1（C17H12O7）标准品5 μg·mL-1、黄曲霉毒素M2标准品（C17H14O7）10 μg·mL-1和13C17-AFTM1同位素溶液（13C17H14O7）0.5 μg·mL-1，均购自坛墨质检标准物质中心。

1.2 仪器和设备

电子天平AB265-S（精度：0.000 01 g，梅特勒-托利多科技（中国）有限公司）；全自动固相萃取仪、全自动氮吹器（睿科集团股份有限公司）；Sciex Qtrap-4500超高效液相色谱串联质谱仪（带离子阱）（上海爱博才思仪器贸易有限公司）；全自动离心机（上海手术器械厂）；黄曲霉毒素M族免疫亲和柱（3 mL，柱容量≥150 ng）（涿州凯斯科生物技术有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

样品提取和净化步骤严格按照《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定》（GB 5009.24—2016）第一法中5.1.1和5.2.2进行。空白实验：在不取样的情况下，按照上述提取和净化程序进行空白试验，需要确认不含有干扰待测成分的物质，上述前处理需全程避光。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱（100 mm×3 mm，2.6 µm）；柱温：40 ℃；流动相：A为5 mmol·L-1乙酸铵溶液，B为乙腈＋甲醇（50＋50）；流速：0.3 mL·min-1；洗脱方式：梯度洗脱。

1.3.3 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；正模式扫描；多反应监测（MRM）模式采集；气帘气（CUR）：30 psi；雾化气（GS1）：50 psi；辅助气（GS2）：50 psi；碰撞气（CAD）：medium；离子喷雾电压：4 500 V；辅助气温度（TEM）：550 ℃。优化仪器条件，使目标色谱峰的灵敏度最高。

1.3.4 方法学验证

按照《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）附录F和《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定》（GB 5009.24—2016）中第一法的要求，本试验方法验证主要包括下面几项。

（1）校准曲线验证。配制AFTM1和AFTM2的浓度均为0.05 μg·L-1、0.40 μg·L-1、0.80 μg·L-1、1.00 μg·L-1、2.00 μg·L-1、4.00 μg·L-1、6.00 μg·L-1和8.00 μg·L-1，13C17-AFTM1浓度为0.45 μg·L-1的系列标准溶液，供HPLC-MS/MS测定，得到标准曲线回归方程，其线性相关系数r应大于0.99。

（2）准确度验证。牛奶中黄曲霉毒素M1限量为0.5 μg·kg-1，目前我国对黄曲霉毒素M2的限量没有明确规定，GB 5009.24—2016中第一法中规定AFTM1和AFTM2的定量限均为0.015 μg·kg-1。因此称取18份阴性牛奶样品，依次添加0.015 μg·kg-1、0.100 μg·kg-1和0.500 μg·kg-1共3个水平浓度，每个水平需做6次重复试验，进行准确度验证。

（3）方法定量限验证。定量限是信噪比等于10时的浓度，该标准方法规定AFTM1和AFTM2的定量限均为0.015 μg·kg-1。称取2份阴性牛奶样品，分别添加0.015 μg·kg-1的AFTM1和AFTM2，进行处理，测定。如果2份加标样品中AFTM1和AFTM2的信噪比S/N均＞10，证明可以满足方法定量限要求。

（4）精密度验证。称取3份阴性牛奶样品，依次添加0.015 μg·kg-1、0.100 μg·kg-1和0.500 μg·kg-1共3个水平浓度，上机重复测定次数至少为6次，计算实验室内变异系数。

1.3.5 创建目标物质二级质谱图

在上述仪器条件基础上建立多反应监测触发增强子离子扫描模式（MRM-IDA-EPI），设定信息依赖触发阈值：1 000 cps；动态背景扣除模式；子离子扫描速度10 000 Da·s-1，扫描范围50～350（m/z）；EPI：1个；碰撞能量为35 V。建立黄曲霉毒素M1、M2的二级全扫描质谱图，获得更全面的碎片信息。

2 结果与分析

2.1 工作曲线及线性相关系数验证结果

按照设定的仪器方法，将标准系列溶液从低到高浓度进行检测，以AFTM1和AFTM2色谱峰与13C17-AFTM1峰面积比值-浓度比值作图，得到AFTM1和AFTM2的标准曲线方程分别为y=2.717 51x-0.005 56和y=2.052 21x+0.017 64，相关系数r分别为0.999 01和0.999 17，满足r＞0.99的要求。

2.2 方法准确度验证结果

以阴性样品加标回收率来验证方法的准确度，在阴性牛奶样品中分别添加0.015 μg·kg-1、0.100 μg·kg-1和0.500 μg·kg-13水平浓度的黄曲霉毒素M1、M2，每个水平需做6次重复试验，加标回收率结果见表1。加标量在0.015～0.500 μg·kg-1时，平均回收率为97.0%～108.0%，相对标准偏差（RSD）≤20%，满足《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）附录F中关于浓度小于0.1 mg·kg-1时，回收率满足60%～120%的要求。

2.3 方法定量限验证结果

由表2可知，该方法中AFTM1和AFTM2定量限0.015 μg·kg-1处的信噪比（S/N）为46～78，均大于10，表明按照上述前处理步骤处理样品，可以满足标准方法中规定的定量限。

2.4 方法精密度验证结果

由表3可知，在阴性牛奶样品中添加黄曲霉毒素M1、M2 0.015 μg·kg-1、0.100 μg·kg-1和0.500 μg·kg-1共3个水平进行6次重复试验，计算得到实验室变异系数为5.1%～11.8%，满足GB/T 27404—2008附录F当被测组分含量≤1.0 μg·kg-1时，变异系数≤30%的要求。