食品中米酵菌酸检测方法研究进展
作者: 蔡洁 罗琳 刘栩晔 姚庆伟 周伟乾 黄奕佳摘 要:基于米酵菌酸食品中毒事件频发的现状,本文总结了食品中米酵菌酸在提取纯化和检测分析技术方面的最新研究进展,以期为后续开发米酵菌酸的高效检测方法提供参考。
关键词:米酵菌酸;提取纯化;检测分析
Abstract: Based on the current situation of frequent food poisoning incidents of bongkrekic acid, this paper summarizes the latest research progress in the extraction, purification, detection and analysis technology of bongkrekic acid in food, providing the reference for developing a high-efficiency detection method of bongkrekic acid in the future.
Keywords: bongkrekic acid; extraction and purification; detection and analysis
近年来,我国南方地区频发湿米粉中毒的公共卫生事件,其诱因在于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌污染食品基质并产生米酵菌酸[1]。米酵菌酸是一种长链脂肪酸结构的细菌毒素,常见于发酵或变质谷物、湿米粉和银耳等食品中且具有很强的急性毒性,严重时可迅速引起肝肾损伤并导致全身多器官功能衰竭[2-3]。
SHI等[4]提出,米酵菌酸可抑制线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转运蛋白(ANT)在ADP磷酸化和ATP水解过程发挥正常作用,通过代谢过程反复损害肝脏、肾脏等器官,影响机体糖类或脂肪代谢、蛋白质合成、凝血功能、体液循环等基础功能,在此期间中毒者体内可能因ATP转运或利用受阻引发肝脏和肌糖原的代偿机制并出现乳酸积累、酸中毒等现象。米酵菌酸引起的中毒事件在中外均有报道,2015年莫桑比克出现大规模酒类中毒事件并造成32%的当事人死亡,起因在于用于酿酒的玉米粉中含有米酵菌酸(21 ng·g-1)[5];2018—2020年间我国中南部地区也曾多次发生因食用含有米酵菌酸的木耳或湿米粉导致的食物中毒事件[6-8]。由于米酵菌酸污染后的食品在气味或色泽上均无明显变化,且相较于蘑菇毒素、河豚毒素等,米酵菌酸作用的食品对象更为广泛,在食品安全领域存在较高风险性,因此对其进行及时监控和有效防范是十分必要的[9]。本文结合最新研究报道,对米酵菌酸的前处理及检测技术进行总结归纳,以期为后续发展高效简便的米酵菌酸检测方法提供思路。
1 食品中米酵菌酸的提取纯化
米酵菌酸具有不饱和三羧酸结构,在温湿度适宜的条件下可由椰毒假单胞菌酵米面亚种通过脂肪酸代谢生成[10]。研究指出,受到基质中糖类和脂肪酸组成及含量的影响,椰毒假单胞菌酵米面亚种着生于不同食品基质后的产毒量有所不同,在8种常见的食品基质中的产毒量依次为银耳粉>土豆粉>玉米粉>牛奶粉>豆腐粉>小米>高粱米>大米[11-12]。
此外,不同食品基质中可能存在性质类似的杂质干扰米酵菌酸检出,这一现象称为基质效应[13]。LAGO等[14]提出食品基质中存在碳水化合物、色素、有机酸等化合物,以液相质谱为例,这类低分子量杂质可能与目标物同时分离流出,在电离和溶质汽化过程影响目标物的离子化效率(抑制或增强),导致低浓度样品呈假阴性或基质复杂样品呈假阳性。基质效应可通过空白基质液校准的方式适当消除,同时这也对目标物的提取纯化工艺提出了一定要求。
当前研究普遍采用溶剂提取后固相萃取的方法提高米酵菌酸的回收率。钟玉心等[15]发现提取剂会明显干扰米酵菌酸在不同基质中的保留,如甲醇-氨水溶液对于米粉、玉米粉等基质中的米酵菌酸有良好的提取效果,但不适用于银耳等高糖基质。对于大部分食品基质,可采用甲醇、乙腈等有机试剂和低比例酸性溶液复合提取,利用甲酸、乙酸等酸性化合物阻断米酵菌酸与基质金属离子间的络合作用,有效抑制米酵菌酸电离,增大米酵菌酸在强极性试剂中的溶解度[16-17]。此外,温海滨[18]提出对于多糖、蛋白质含量较高的基质(如黑木耳),直接上柱大概率会导致萃取柱堵塞,影响米酵菌酸的提取效率,因此液液萃取时可加入无水硫酸铵、硫酸镁等使杂质沉降,降低上清液黏度。在固相萃取材料的选择方面,李红艳等[19]认为米酵菌酸作为一种可解离的酸性毒素,其结构上的羧基能与WAX阴离子固相萃取柱上的氨基发生离子交换,净化后可有效富集米酵菌酸并去除玉米面中的碱性或极性物质。LIANG等[20]开发了一种Fe3O4/HNTS磁性固相萃取材料,这种材料对米粉中米酵菌酸的提取效率可达93.5%,其原理在于材料外表存在低密度羟基和电荷,在pH 4.4条件下可以选择性与米酵菌酸的羧基结合,且在乙腈-1%甲酸溶液作用下可以完全洗脱。
有研究将QuEChERS法、液相微萃取法(Liquid Phase Micro-Extraction,LPME)等新型前处理技术应用于米酵菌酸的提取中。QuEChERS法主要分为盐析和分散固相萃取两部分,利用硫酸镁、钠盐等提取盐的盐析效应使目标物从复杂基质中分离并扩散至萃取剂乙腈中,再通过多孔吸附剂和盐进一步净化减少杂质,具有绿色、快速、简单的特点[21]。梁明等[22]以乙腈-水为提取液,依次将河粉基质上清液转移至EMR-Lipid萃取柱和EMR-Polish管中离心并纯化,处理后米酵菌酸的回收率高达90%以上,且没有基质效应影响。液相微萃取法则是一种基于液液萃取的微量萃取技术,通过调节物理或化学条件,使目标物在不互溶的两相间选择性转移。过程中试剂使用量少,一般以微升计[23]。黄媛等[24]探究了漂浮有机液滴凝固液相微萃取法中不同因素对米酵菌酸提取效果的影响,这种方法要求萃取剂低熔点、低密度,目标物扩散至萃取剂后,通过低温凝固实现萃取剂与水相分离。实验中发现冰浴条件下以30 μL十二醇和300 μL丙酮分别作为萃取剂和分散剂的效果最好,适用于银耳、玉米粉、米粉等基质中米酵菌酸的富集。
2 食品中米酵菌酸的检测分析
米酵菌酸作为一种低剂量致死毒素,有很高的公共安全危害性。但鉴于米酵菌酸无色无味,日常无法通过感官直接判断其是否存在于食品中,需要辅以实验分析技术辨别[25]。近年来,有关食品中米酵菌酸的检测方法发展迅速,早前使用的薄层色谱法、分光光度法等因流程复杂、灵敏度差、特异性不明显等缺点已逐渐被淘汰,并建立了以液相色谱、质谱联用等仪器为基础的检测方法或快检技术[26]。
2.1 高效液相色谱法
《食品安全国家标准 食品中米酵菌酸的测定》(GB 5009.189—2016)将液相色谱法作为银耳或米面制品中米酵菌酸的检测方法,但该标准适用范围较小,且前处理流程复杂,试剂消耗量大。有报道参照标准,以优化上机工艺或扩大液相色谱在米酵菌酸检测中的应用为方向进行研究。康翠欣等[27]提出流动相pH对米酵菌酸在色谱柱中的保留效果影响较大,用酸性流动相可以抑制米酵菌酸离子化,增加其在色谱柱中的保留,并减少米酵菌酸结构上的羧基与固定相中残存硅醇基结合,改善色谱峰峰形,但甲酸和乙酸体系的差异不大;该研究同时提出,相较于乙腈,以高比例甲醇作为流动相有利于出峰时间提前,目标物与杂质分离效果也较好。周霞等[28]以1%乙酸水和甲醇为流动相,在二极管阵列检测器267 nm波长下检测米酵菌酸,该方法检出限为0.002 5 mg·kg-1,在玉米面、米粉等基质中均有较高响应。俞穗珍[29]在267 nm波长下检测银耳中的米酵菌酸,并提出10~30 μL范围内提高进样量,会导致目标物峰形不佳,拖尾现象明显。陈嘉聪等[30]公开了一种二极管阵列检测器-液相色谱方法,以甲醇和甲酸水为流动相进行梯度洗脱,在258 nm波长下检测,结果表明该方法在0.5~25 μg·mL-1浓度内线性良好,可广泛应用于谷类、薯类、湿米粉类等大部分可能含有米酵菌酸的食品。但就实验操作和结果精确度方面而言,高效液相色谱法仍存在分析时间长、检出限高、取样量大等局限性。
2.2 超高效液相质谱法
相较于液相色谱法,超高效液相质谱法针对米酵菌酸检测的灵敏度更高,定性定量更准确,适用于大批量样品的检测。张伟等[31]发现米酵菌酸分子上带有羧基,在离子源处易电离成带负电离子,因此选用负离子模式检测米酵菌酸响应更好;该研究以乙腈和乙酸铵溶液为流动相梯度洗脱,在酵米面基质中米酵菌酸的回收率可达88%以上。张洁等[32]建立了一种快速测定木耳中米酵菌酸的质谱方法,并对流动相、质谱参数等测试条件进行优化,优化后采用负离子模式检测,并以母离子m/z 485.4进行子离子全波长扫描,检出限低且目标物分离度好。FALCONER等[33]将液相质谱法用于发酵饮料中米酵菌酸的测定,采用负离子和多反应监测模式;实验中发现该方法可同时进行异米酵菌酸(米酵菌酸的同分异构体,光照或碱性条件下转化生成)的定性定量。覃冬杰等[34]以螺蛳粉为检测对象,对比了不同流动相组合对质谱检测效果的影响,发现甲酸在负离子模式下可能会抑制米酵菌酸电离进而影响目标物峰形,以乙腈和含0.1%甲酸的甲酸铵为流动相时峰形最好且响应偏高。
2.3 快速检测法
快速检测法是基于目标物与特定物质结合发生荧光或免疫等反应的分析方法,常见如胶体金法、荧光层析法、酶联免疫吸附法等[35]。相较于大型仪器检测,快速检测法具有操作简便、快速定性、对仪器依赖性低的特点,适用于现场抽查、大批量样品快筛等检测工作。张小波等[36]开发了一种根据显色强度判定米酵菌酸含量的荧光定量检测卡,在1~100 ng·mL-1浓度内线性良好,可有效实现米面、银耳等食品中米酵菌酸的快速定量。吕晓静等[37]根据米酵菌酸分子与载体蛋白偶联形成抗原,可与特异性抗体结合的免疫原理,公开了一种由抗原-抗体分子对应吸光度定量的酶联免疫试剂盒,该试剂盒对米酵菌酸的检测灵敏度低至10 μg·L-1,可针对性检测发酵玉米制品、银耳等食品。万宇平等[38]发明了一种基于米酵菌酸分子与载体蛋白偶联,结合抗体后可与抗原偶联蛋白竞争显色的胶体金试纸条,对银耳、酵米面等食品中米酵菌酸的定量低限为5 μg·kg-1,且假阳性率低。ZHANG等[39]将半胱胺改性金纳米粒子作为比色探针,在样品阳性条件下可以诱导粒子聚集显色,并通过手机应用程序测定基质液显色值,在0.10~1.44 μmol·L-1浓度可准确量化基质中米酵菌酸的浓度。
3 结语
米酵菌酸分布的食品基质范围较广且难以依靠常规方法将其去除,存在较高的食用风险,这对米酵菌酸的检测工作提出了严格要求。目前米酵菌酸的检测工作主要参照《食品安全国家标准 食品中米酵菌酸的测定》(GB 5009.189—2016)进行,但该方法前处理流程长,不适用于大批量样品的筛查。因此,有必要建立更为简便高效的检测方法。近年来,已有大量研究在米酵菌酸的提取纯化和检测分析技术领域进行有益探索,以期在降低基质效应、提高米酵菌酸上机纯度的基础上缩短实验流程,提高分析定量的准确度,这为开发高精密度、高分析通量的检测方法开辟了新思路。
参考文献
[1]ANWAR M,KASPER A,STECK A R,et al.Bongkrekic acid-a review of a lesser-known mitochondrial toxin[J].Journal of Medical Toxicology,2017,13(2):173-179.
[2]KANO A,IWASAKI T,SHINDO M.Bongkrekic acid facilitates glycolysis in cultured cells and induces cell death under low glucose conditions[J].Biochemistry and Biophysics Reports,2019,20:100683.