液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中雷公藤甲素的不确定度评定

摘 要：按照《蜂蜜中雷公藤甲素的测定》（BJS 202108），使用高效液相色谱-串联质谱法测定阳性蜂蜜样中雷公藤甲素含量，对标准溶液配制、标准工作曲线制备、样品溶液配制、样品测量重复性和样品加标回收率5个方面进行不确定度评定。结果显示，自制阳性样平均值为1.01 μg·kg-1，在95%置信区间，包含因子为2，扩展不确定度为0.10 μg·kg-1。不确定度主要来源于标准工作曲线的制备，其中包括标准工作曲线的配制及拟合。

关键词：不确定度；雷公藤甲素；蜂蜜；液相色谱-串联质谱

Evaluation of Uncertainty in Determination of Triptolide in Honey by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZENG Hui， DENG Nan， LIU Chuan， WANG Zhaoxia， YIN Fangping， YUAN Yuan*

（Changsha Institute for Food and Drug Control， National Alcohol Products Quality Inspection and Testing Center， Changsha 410000， China）

Abstract： According to BJS 202108， the content of triptolide in positive honey samples was determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The uncertainty of preparation of standard solution， preparation of standard working curve， preparation of sample solution， repeatability of sample measurement and recovery rate of sample were evaluated. The results showed that the mean value of self-made positive samples was

1.01 μg·kg-1， with a factor of 2 and an extended uncertainty of 0.10 μg·kg-1 in the 95% confidence interval. The uncertainty mainly comes from the preparation of the standard working curve， including the preparation and fitting of the standard working curve.

Keywords： uncertainty; triptolide; honey; liquid chromatography-tandem mass spectrometry

在我国云南、广西等南方省份，多次发生食用蜂蜜中毒事件[1]。据文献报道，在1972—2016年，中毒374人以上，死亡58人。有毒的蜜粉源主要有雷公藤、博落回、钩吻等，而能确定有毒蜜粉源植物名称或清楚中毒化学成分的事件未达到1/3，对中毒来源难以追溯[2]。根据2016年湖北和福建蜂蜜中毒死亡事件的调查，造成致死的有毒蜜源主要是雷公藤和昆明山海棠中的雷公藤甲素[3-4]。人类食用毒蜜后对肝、肾、生殖器官及免疫系统有一定损伤[5-6]。

雷公藤甲素是从雷公藤和昆明山海棠中分离得到的主要活性成分，为二萜类化合物，分子式为C20H24O6，呈白色针状晶体，在水中难以溶解，而在甲醇、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂中容易溶解。根据《蜂蜜中雷公藤甲素的测定》（BJS 202108）用液相色谱-串联三重四极杆质谱测得其含量只是被测量的估计值，测量过程中的随机效应及系统效应均会导致测量不确定度[7]。目前，关于测定蜂蜜中雷公藤甲素的含量还没有不确定度评定的报道，为得到可靠的实验数据，本文对实验过程中的不确定度来源进行分析和评定，从而提高检测检验质量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

自制阳性蜂蜜（市售蜂蜜加入雷公藤甲素）；雷公藤甲素标准品（纯度99.6%），中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯），默克化工技术有限公司；甲酸（色谱纯）、乙酸乙酯（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ME204E万分之一分析天平（感量0.000 1 g）、XS205DU十万分之一分析天平（感量0.000 01 g），梅特勒-托利多仪器有限公司；1290-6470液相色谱-串联质谱仪、SB-C18柱，安捷伦科技有限公司；TurboVap LV氮吹仪，Biotage；X1R离心机，赛默飞世尔科技有限公司；Fotector-06全自动固相萃取仪，睿科集团（厦门）股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

（1）雷公藤甲素标准储备液（1.00 g·L-1）的配制。准确称取10.00 mg雷公藤甲素标准品于容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 mL。

（2）雷公藤甲素标准中间液（1.00 mg·L-1）的配制。准确量取100 μL雷公藤甲素标准储备液于容量瓶中，用甲醇稀释定容至100 mL。

（3）雷公藤甲素标准工作溶液的配制。准确量取雷公藤甲素标准中间液用空白样品基质稀释，分别配制成2 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1、25 μg·L-1、50 μg·L-1和80 μg·L-1的基质标准工作溶液。基质标准工作曲线以基质标准工作溶液浓度为横坐标，纵坐标为峰面积绘制。

1.3.2 样品处理

称取2 g蜂蜜（精确至0.1 mg）于50 mL离心管中，加入4 mL水与蜂蜜混匀，加入15 mL乙酸乙酯涡旋振荡5 min再超声10 min提取，高速离心5 min，取上清液。再加入15 mL乙酸乙酯提取1次，合并两次提取的上层有机溶剂，旋转蒸干后用2 mL乙酸乙酯溶解，过PSA固相萃取柱，用5 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液氮气吹干。准确量取1 mL甲醇溶液复溶，过滤后供液相色谱-串联质谱测定[8]。

1.3.3 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：SB-C18柱（100 mm×

2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL·min-1；柱温：20 ℃；进样量：5 μL；流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱：0～0.50 min，90%A；0.50～

4.00 min，90%A→5%A；4.00～6.00 min，5%A→

3%A；6.00～6.50 min，3%A；6.50～7.00 min，3%A→90%A；7.00～10.00 min，90%A。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源；检测方式：多反应模式；扫描方式：正离子模式扫描；离子对：361.1/127（定量离子对），361.1/105.2，361.1/141.2；碎裂电压：145 eV；碰撞能量：80 eV。

1.3.4 数学模型

雷公藤甲素含量的计算公式为

（1）

式中：X为试样中雷公藤甲素的含量，μg·kg-1；ρ为由标准曲线得出的被测组分溶液质量浓度，

μg·L-1；V为定容体积，mL；f为稀释倍数；m为试样质量，g；1 000为换算系数[9]。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源

测定蜂蜜中雷公藤甲素的不确定度主要来源于标准溶液配制、标准工作曲线制备、样品溶液配制、样品测定重复性和样品加标回收率几个方面。

2.2 不确定度计算

2.2.1 标准溶液配制引入的不确定度urel（r）

（1）标准品纯度引入的不确定度urel（r1）。根据雷公藤甲素标准品的证书，其纯度为99.6%，标准偏差为0.4%，按矩形分布，k=，其标准不确定度为，相对标准不确定度为

（2）标准品称量引入的不确定度urel（r2）。根据天平的检定证书和《电子天平检定规程》（JJG 1036—2008），十万分之一天平称量范围为m＜20 g时，U=0.000 03 g，k=2，称量过程包含去皮、称重两个步骤，故g。称取雷公藤甲素标准品0.010 25 g，则

（3）标准品定容引入的不确定度urel（r3）。标准品定容引入的不确定度主要来源于溶剂的膨胀系数、玻璃量器的允许误差[10]。配制标准品的溶液为甲醇，甲醇的膨胀系数为0.001 19 ℃-1，实验室温度为（20±5）℃，故温度偏差产生的溶剂体积增量为10×0.001 19×5=0.059 5 mL，按照均匀分布，

包含因子k=，则mL。按照JJG 196—2006和检定证书，10 mL容量瓶（A级）U=0.006 mL，k=，则

mL

则配制雷公藤甲素标准储备液引入的相对不确定度为

（4）标准溶液稀释引入的不确定度urel（r4）。根据检定证书和检定规程，10～100 μL移液器的最大允许误差为±2%，按矩形分布计算，k=，

mL；重复度最大允许误差

为1%，则mL。溶剂因温

度造成的膨胀系数引入的误差为

mL

故移液器引入的相对标准不确定度为

100 mL容量瓶用甲醇定容，因温度产生的不确定度为

mL

100 mL的容量瓶（A级）U=0.03 mL，k=，则

u（r9）mL。

则容量瓶引入的相对标准不确定度为

标准溶液稀释引入的相对标准不确定度为

因此，由标准品引入的相对标准不确定度为

2.2.2 标准工作曲线制备引入的相对不确定度urel（v）

（1）配制标准工作曲线引入的不确定度urel（v1）。分别用10～100 μL和100～1 000 μL移液器移取标准品中间液20 μL、50 μL、100 μL、250 μL、500 μL

和800 μL置于10 mL容量瓶中，用空白样品基质稀释定容至刻度。空白样品基质为甲醇溶液，膨胀系数为0.000 699 ℃-1。配制标准工作曲线过程中玻璃容器和移液器引入的不确定度详见表1。

（2）标准工作曲线拟合引入的不确定度urel（v2）。标准工作曲线测3次，按照外标法拟合，得到线性方程为Y=66.780 168 73X-5.129 430 26，其相关系数R2=0.997 1，标准系列工作溶液峰面积的标准偏差为

标准系列工作溶液的相对标准不确定度为

标准曲线引入的不确定度见表2。

因此，。

2.2.3 样品溶液配制引入的不确定度urel（m）

（1）试样称量引入的不确定度urel（m1）。根据天平的检定证书和检定规程，万分之一的分析天平U=0.000 3 g，k=2，样品重复称量7次，平均值为

2.072 0 g，故相对标准不确定度为