超高效液相色谱-串联质谱法测定全麦粉中的赭曲霉毒素A

摘 要：目的：建立超高效液相色谱-串联质谱法测定全麦粉中赭曲霉毒素A的含量。方法：全麦粉样品经甲醇-水（60∶40，V∶V）提取，磷酸盐缓冲溶液稀释，赭曲霉毒素A免疫亲和柱净化，超高效液相色谱-串联质谱测定分析，内标法定量。结果：赭曲霉毒素A在0.475～9.500 ng·mL-1具有良好的线性关系（R2=0.999 9），3个加标水平下的平均回收率为85.62%～99.42%，相对标准偏差为1.92%～4.66%，检出限为0.68 μg·kg-1、定量限为2.27 μg·kg-1。结论：该方法便捷、稳定、灵敏度高、准确度好，可用于快速分析全麦粉中赭曲霉毒素A的含量。

关键词：全麦粉；赭曲霉毒素A；超高效液相色谱-串联质谱

Determination of Ochratoxin A in Whole Wheat Flour by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

TANG Dehong， ZHANG Ji， ZHANG Bingxue， REN Wei， ZHANG Dandan， LIU Chong*

（Product Quality Inspection and Testing Institute in Zunyi， Zunyi 563000， China）

Abstract： Objective： To establish an ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of ochratoxin A in whole wheat flour. Method： Whole wheat flour samples were extracted with methanol water （60∶40， V∶V）， diluted with phosphate buffer solution， purified with ochratoxin A immunoaffinity column， analyzed by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry， and quantified by internal standard method. Result： Ochratoxin A ranges from 0.475 ng·mL-1 to 9.500 ng·mL-1 has a good linear relationship （R2=0.999 9）. The recovery rates at three spiked levels were 85.62%～99.42%，the relative standard deviation was 1.92%～4.66%， and the detection limit was 0.68 μg·kg-1， with a quantification limit of

2.27 μg·kg-1. Conclusion： This method is convenient， stable， sensitive， and accurate， and can be used for rapid analysis of ochratoxin A content in whole wheat flour.

Keywords： whole wheat flour; ochratoxin A; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是食物中最常见的霉菌毒素之一[1]，是曲霉属和青霉属的真菌形成的次级代谢产物[2-4]，广泛存在于各种食物中。其中，谷物及其副食品是赭曲霉毒素A的主要来源，其具有较强的肝毒性、肾毒性及免疫毒性，并可能致癌、致畸、致突变[5-8]，被认为是仅次于黄曲霉毒素类的真菌毒素类致癌物[9-13]。因此，防止污染赭曲霉毒素A的食品直接进入人类食物链，加强对赭曲霉毒素A的检测具有重要意义。

近年来，用于分析食品中赭曲霉毒素A的方法有高效液相荧光检测法、薄层色谱测定法、酶联免疫吸附法和高效液相色谱质谱法等，其中高效液相荧光检测法较为常用，但该方法限制条件严苛，影响结果的因素较多，且实测样品全麦粉基质较为复杂。高效液相色谱-串联质谱法（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）兼具液相色谱和质谱的特点，其灵敏度高、定量限低、选择性强、精密度高，且具有较好的分离能力。在数据定量过程中，该方法可排除样品中的假阳性结果，进一步确保实验数据和结果的准确性和可靠性。

全麦粉是小麦加工制成的具有纯籽粒营养的面粉，外层麸皮含有大量的粗纤维、抗性淀粉和低聚糖，对糖尿病患者身体健康尤为有利，可能会改善糖循环、降低血糖指数、血脂水平[14-16]，生活中可作为大多数烘焙食品的原料。全麦粉作为国家食品安全监督抽检实施细则中的重点品种，赭曲霉毒素A为其必检项目，其主要来源于种植培育阶段、收割存储过程，受病害虫、温湿度、生长环境土壤气候影响[17]，容易在作物发生霉变后产生，及时发现能有效减少其对人体的危害。

《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》

（GB 2761—2017）和《食品安全国家标准 食品中赭曲霉毒素A的测定》（GB 5009.96—2016）对谷物类、豆类、酒类、咖啡类等的限量值及相关要求进行了规定，但由于小麦粉粒径较细，经原料直接粉碎后麸皮含量高、颜色深，基质复杂，常规的净化方法处理杂质不完全，受基质影响较大导致回收率低。基于此，本实验在国家标准的基础上，以未知浓度的考核样品、质控样品为研究对象，选择比较不同的免疫亲和柱，鉴于赭曲霉毒素A本身的特性优化不用的洗脱溶剂，结合高灵敏度的超高液相色谱-串联质谱法（Ultra High Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS），建立快捷高效准确的分析方法，为实际生活中测定全麦粉中赭曲霉毒素A提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

全麦粉样品购自国家粮食和物资储备局科学研究院，分别为全麦粉A、全麦粉B、全麦粉C，全麦粉阴性样品、质控样品。

1.2 仪器

1290-G6495超高效液相-串联质谱仪（美国Agilent公司）；3-30KS型高速离心机（美国Sigma公司）；Milli-Q超纯水仪（美国密理博公司）；AB265-S型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；HT-200多管涡旋混匀仪（上海沪析实业有限公司）；赭曲霉毒素A免疫亲和柱。

1.3 试剂

赭曲霉毒素A（OTA）标准溶液（1.9 μg·mL-1，国家粮食局科学研究院）；赭曲霉毒素A稳定同位素（[13C]-OTA）标准溶液（0.1 μg·mL-1，奥地利Romer公司）；乙腈、甲醇均为质谱级（美国天地有限公司）；乙酸（色谱纯，天津市科密欧试剂有限公司）；水为实验室自制。

1.4 实验方法

1.4.1 PBS缓冲溶液的配制

准确称量8.0 g氯化钠，1.2 g磷酸氢二钠，

0.2 g磷酸二氢钾，0.2 g氯化钾，加适量水超声使其完全溶解，加水定容至1 L。洗脱液由98 mL甲醇和2 mL冰乙酸混合而成。

1.4.2 标准溶液的配制

分别精密移取OTA标准溶液、同位素内标液适量，用乙腈分别稀释成浓度为95 ng·mL-1、20 ng·mL-1的中间储备液，于-20 ℃冰箱中储存。临用时移取中间储备液适量，用乙酸-甲醇溶液配制浓度分别为

0.475 ng·mL-1、0.950 ng·mL-1、1.900 ng·mL-1、

4.750 ng·mL-1和9.500 ng·mL-1的系列标准溶液，每个标准系列的溶液内标含量均为1 ng·mL-1，现配现用。

1.4.3 样品制备

准确称取5 g试样，加入一颗陶瓷均质子，准确加入20 mL提取液（乙腈∶水=60∶40），置于涡旋振荡器，2 500 r·min-1提取30 min，11 000 r·min-1离心5 min，准确移取上清液2 mL，加入10 μL内标储备液（浓度0.1 μg·mL-1的内标溶液），再加入13 mL PBS溶液稀释，混匀，11 000 r·min-1离心5 min。取出免疫亲和柱，恢复至室温。将免疫亲和柱连接于注射器下，以每秒1～2滴的流速使稀释液通过免疫亲和柱，用20 mL水淋洗，弃去全部流出液，用剪去尖端的洗耳球抽干小柱，滤纸擦拭干亲和柱内壁水珠。准确加入2.0 mL冰乙酸-甲醇洗脱液，收集全部洗脱液于试管中，经0.22 μm滤膜过滤，进样分析。阴性样品、质控样品处理方法同上。

1.4.4 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；进样体积：5 μL；流动相：A相为乙腈，B相为0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱，洗脱程序：0～

1.0 min，70%B；1.0～2.5 min，70%B→40%B；2.5～

4.0 min，40%B→0%B；4.0～5.0 min，0%B；5.0～

6.0 min，0%B→40%B；6.0～8.0 min，70%B。

（2）质谱条件。离子源为带有Agilent喷射流技术的电喷雾离子源；干燥气温度：250 ℃；干燥气流量：11 L·min-1；喷嘴电压：35 psi；鞘气温度：350 ℃；鞘气流量：12 L·min-1；电喷雾电压为4 000 V；采用正离子扫描模式，多反应监测模式进行检测。

2 结果与分析

2.1 检测条件的优化

分别在正离子模式和负离子模式下，选择Q1 MS1全扫描模式进行母离子扫描，获得在对应模式下的质荷比，利用Q3 MS2碎片离子扫描模式，寻找二级质谱碎片离子。在优化过程中，发现负离子模式下母离子响应较低，且碎片离子较少，所以选择正离子模式分析，选择响应最高的两个碎片分别作为定量离子和定性离子。碰撞能以5 V为间隔，从15 V调至50 V，优化碰撞能，观察被测组分出峰时间，确保图谱由12～15个采集点构成，确定驻留时间，最后采用多反应监测模式进行检测，相关定量及定性检测离子条件见表1。

2.2 赭曲霉毒素A免疫亲和柱的选择

在实验过程中，同时选择了A、B、C 3个不同生产厂家的具有相同柱容量和柱体积的免疫亲和柱进行净化测定，测定的原理均为基于抗原抗体反应，赭曲霉毒素A抗体连接在柱内凝胶上，样品中赭曲霉毒素A抗原经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液缓慢通过赭曲霉毒素A免疫亲和柱，在柱内与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他物质，用洗脱液洗脱赭曲霉毒素A，注入UPLC-MS/MS仪器中检测。结果发现，厂家A的免疫亲和柱回收率相对偏低，且批间稳定性差异较大，厂家B和厂家C的免疫亲和柱回收率均为85%以上，综合考虑成本价格，最终选择厂家B的免疫亲和柱进行本次实验。

厂家A回收率偏低的原因有以下几点：①由于赭曲霉毒素A中含有保护凝胶和抗体的PBS溶液，只能陆路运输，运送时间较长，无法确保整个运输过程中的温度与赭曲霉毒素A要求的储藏温度一致，可能导致回收率偏低；②免疫亲和柱的柱空白，即免疫亲和柱自身本底可能会干扰赭曲霉毒素A的测定，从而影响回收率；③免疫亲和柱内抗体对有机溶剂的耐受性，样品经提取过滤，会用一定体积倍数的PBS溶液稀释，使其有机溶剂的含量在10%以下，以避免对抗体的破坏。

2.3 洗脱溶剂的选择