液相色谱-串联质谱法测定徽州毛豆腐中18种氨基酸

摘 要：本文建立了徽州毛豆腐中18种氨基酸快速检测的方法，样品以沸水浸提，以液相色谱-串联质谱法测定。结果显示，该方法在9 min内可完成所有氨基酸的分离，检出限为2.44～6.36 μg·kg-1，定量限为8.05～20.99 μg·kg-1，加标回收率在83.60%～101.20%，相对标准偏差在0.27%～2.61%。该方法具有分析速度快、重复性好等优点。

关键词：氨基酸；液相色谱-串联质谱；徽州毛豆腐

Determination of 18 Amino Acids in Huizhou Maotofu by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

HAO Yuling1， SHENG Xinying1*， WU Wenwen1， XU Yayuan2， CHENG Jianghua2， ZHANG Lei3

（1.Anhui Kebo Product Testing and Research Institute Co.， Ltd.， Hefei 230001， China; 2.Institute of Agricultural Products Processing， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei 230031， China; 3.Anhui Institute of Food and Drug Inspection， Hefei 230021， China）

Abstract： This article establishes a rapid detection method for 18 amino acids in Huizhou Maotofu. The samples are extracted with boiling water and determined by liquid chromatography tandem mass spectrometry. The results showed that the method could complete the separation of all amino acids within 9 minutes， with a detection limit of 2.44～6.36 μg·kg-1， a quantification limit of 8.05～20.99 μg·kg-1， an spiked recovery rate of 83.60%～101.20%， and a relative standard deviation of 0.27%～2.61%. This method has the advantages of fast analysis speed and good repeatability.

Keywords： amino acids; liquid chromatography tandem mass spectrometry; Huizhou Maotofu

徽州毛豆腐因其长毛和口感独特等特征，成为我国著名的素食佳肴。豆腐经过特殊处理，在独特的环境条件下进行发酵处理，表面会长出一层白灰色绒毛状菌丝，在豆腐的发酵过程中，蛋白质被分解成各种不同的氨基酸，并因此形成了独特的风味，食后味道鲜醇爽口、芬芳诱人、软糯鲜美，是中国徽菜中最具地方特色传统风味菜肴之一[1]。毛豆腐的主要原材料为大豆，大豆具有很高且全面的营养

素[2-4]。发酵豆制品随着有益菌种的增加，不仅产生了丰富的营养物质，同时也具备了许多生理功能效果[5]，研究表明发酵豆制品具有抗癌、溶解血栓、降血压、抗氧化、抗菌等生理功能[6]。

在大豆发酵过程中，蛋白质在蛋白酶的作用下水解为多肽，小分子肽链水解为游离氨基酸，它的生成大大提高了蛋白质的消化率[7]，更有利于人体对蛋白质的消化、吸收和利用。氨基酸不但营养价值高[8]，也是重要的呈味物质，是发酵豆制品独特风味形成的因素[9]。其中，天冬氨酸和谷氨酸是重要的鲜味物质，而亮氨酸和异亮氨酸则是苦味氨基酸，甘氨酸和色氨酸则是很好的甜味氨基酸[10-11]。目前有关氨基酸检测方法较多，然而传统的衍生化法等存在分析检测限高以及测定速度慢等缺点，使其在氨基酸检测领域中的应用受到了较大限制[12]。因此，建立快速、准确和重现性好的测定氨基酸的方法具有重要的实用意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

徽州毛豆腐样品由安徽省某科研院所提供。氨基酸的标准品：18种氨基酸混标溶液，其中胱氨酸为1.25 μmol·L-1，其他17种均为2.5 μmol·L-1，天津阿尔塔科技有限公司。

1.2 仪器与设备

液相色谱-质谱联用仪，LC-MS岛津（中国）有限公司；实验室纯水系统（Medium-S300），上海和泰仪器有限公司；垂直多用振荡器（HY-1A），金坛市金城国胜实验仪器厂；多管涡旋混匀器（MIX-200），拓赫机电科技（上海）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

采用Discovery HS F5-3（150 mm×2.1 mm，3 μm）色谱柱，柱温为35 ℃，流速为0.3 mL·min-1，进样量为2 μL，洗脱时间为10.5 min，流动相A为0.1%甲酸-水，流动相B为0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脱程序见表1。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子（ESI）源，正电离模式；干燥气温度：400 ℃；干燥气流速：10 L·min-1；雾化气流量：

3 L·min-1；反应模式：MRM；离子对、碰撞能量见

表2。

1.3.3 标准溶液的制备

（1）混合氨基酸标准中间液配制。准确吸取

1.0 mL的18种混合氨基酸标准储备液于10 mL容量瓶中，用0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释并定容至刻度，混匀，其中胱氨酸的质量浓度为125 nmol·mL-1，其余的17种混合氨基酸标准溶液，配制质量浓度均为250 nmol·mL-1。

（2）混合氨基酸标准工作溶液配制。准确吸取

1.0 mL的18种混合氨基酸标准中间液于10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液稀释并定容至刻度，混匀后即得第一份标准溶液，随后用50%乙腈溶液逐级稀释，制成共7个不同浓度的系列混合标准工作溶液，质量浓度分别为0.1 nmol·mL-1、0.2 nmol·mL-1、0.5 nmol·mL-1、

0.8 nmol·mL-1、1.0 nmol·mL-1、1.5 nmol·mL-1、

2.0 nmol·mL-1，其中胱氨酸的质量浓度分别为

0.05 nmol·mL-1、0.10 nmol·mL-1、0.25 nmol·mL-1、

0.40 nmol·mL-1、0.50 nmol·mL-1、0.75 nmol·mL-1、

1.0 nmol·mL-1，现配现用。

1.3.4 样品氨基酸提取制备

参照方法GB/T 30987—2020[13]，根据样品特点加以改进和优化，称取2.0 g徽州毛豆腐样品（精确至0.01 g）于250 mL锥形瓶中，加入200 mL沸水浸提，95 ℃水浴加热，每隔5 min混匀一次，10 min后取出，趁热抽滤，滤液冷却至室温后，用水定容至

250 mL，混匀后移取1 mL提取液于10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液稀释并至刻度混匀，取2 mL稀释液于5 000 r·min-1下离心10 min，取上清液过0.45 μm水相滤膜，待测定。

2 结果与分析

2.1 氨基酸的色谱图

18种氨基酸的色谱图见图1，各氨基酸按照出峰顺序依次为1胱氨酸（1.370 min）、2丝氨酸（1.412 min）、3天冬氨酸（1.415 min）、4甘氨酸（1.448 min）、5苏氨酸（1.559 min）、6丙氨酸（1.640 min）、7谷氨酸（1.644 min）、8赖氨酸

（1.977 min）、9脯氨酸（1.980 min）、10组氨酸

（2.032 min）、11精氨酸（2.334 min）、12缬氨酸（3.707 min）、13蛋氨酸（4.163 min）、14酪氨酸

（5.189 min）、15异亮氨酸（5.608 min）、16亮氨酸（5.808 min）、17苯丙氨酸（6.190 min）、18色氨酸（7.693 min）。

2.2 线性关系、检出限和定量限

使用初始流动相将混合标准溶液稀释，形成不同质量浓度的标准溶液，然后再进行液相色谱-串联质谱分析。以标准工作液质量为横坐标，以各氨基酸峰面积为纵坐标制作标准曲线，见表3，各分析物的标准曲线的相关系数R2均＞0.995，线性相关性较好；取混合标准溶液用50%乙腈水溶液稀释后测定，以3倍信噪比作为方法的检出限，以10倍信噪比作为方法的定量限，获得目标物的检出限和定量限[14]，本方法18种氨基酸的检出限为2.44～6.36 μg·kg-1，定量限为8.05～20.99 μg·kg-1。

2.3 回收率和精密度

取一组徽州毛豆腐中样品，先用本试验建立的方法测定其18种氨基酸的含量，再向该样品中添加量为20 mg·kg-1的氨基酸混合标准溶液，扣除样品空白试验的各氨基酸含量，求得各氨基酸的加标回收率。由表4可知，加标回收率在83.60%～101.20%，相对标准偏差在0.27%～2.61%。

2.4 实际样品中氨基酸的检测

采用本方法对6批次不同发酵时期的徽州毛豆腐中的18种氨基酸含量进行测定，由表5可知，徽州毛豆腐样品中均检测到了18种氨基酸，主要氨基酸是精氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等，发酵时间对游离氨基酸含量影响较大[15]。研究表明，发酵豆制品中的咸、鲜特征滋味主要来源于氨基酸及短肽，如谷氨酸与氯化钠协同作用可提升鲜

味[16-17]，部分短肽如丙氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸对发酵豆制品有提鲜作用[18]，因此快速检测徽州毛豆腐中的18种氨基酸对于毛豆腐的发酵生产具有重要的指导意义。

3 结论与讨论

实验使用液相色谱-串联质谱法测定毛豆腐中的氨基酸，结果显示，此方法检测时间较短（10.5 min），检出浓度更低，检出限为2.44～

6.36 μg·kg-1，定量限为8.05～20.99 μg·kg-1，18种游离氨基酸的线性关系良好，相关系数均大于0.995，加标回收率在83.60%～101.20%，相对标准偏差在0.27%～2.61%，本方法适用于徽州毛豆腐等发酵豆制品中18种氨基酸含量的检测。

利用新建方法提取简单、快速和准确的优势对6批次毛豆腐进行检测，发现样品中均检测到了18种氨基酸，其含量随着发酵时间延长而增加。该方法还可作为酱油、豆酱、腐乳等其他发酵食品中氨基酸的检测，具有较好的实用性。

参考文献

[1]李婷婷.徽州传统毛豆腐中优势微生物的筛选及应用[D].合肥：安徽农业大学，2021.

[2]王金生，闫晓艳，吴俊江，等.大豆营养高效利用型品种筛选[J].大豆科学，2020，39（5）：696-702.

[3]汤小明.豆渣膳食纤维的制备及其改性研究[D].南昌：南昌大学，2015.