动物食品中硫酸沙丁胺醇残留物的TLC-SERRS分析

作者: 曹萌 许凤 张宏莲 梁鑫 徐涛 李骞

动物食品中硫酸沙丁胺醇残留物的TLC-SERRS分析0

摘 要:目的:建立薄层色谱与表面增强共振拉曼光谱联用技术检测苯乙胺类拟肾上腺素硫酸沙丁胺醇药物残留的方法。方法:使用微波加热法用硝酸银和柠檬酸钠制备表面增强剂银溶胶;对所制备的银溶胶进行参数测定,选择表面增强效果较好的银溶胶;应用表面增强共振拉曼光谱法检测硫酸沙丁胺醇时,在TLC板分离出的目标斑点上滴加芳香族重氮盐和表面增强剂银溶胶后再检测其拉曼光谱,并对市售猪肝进行样品检测。结果:该方法可显著增强拉曼光谱的检测信号,增强因子可达到1.65×107。结论:本方法专属性强、耐用性好,为苯乙胺类拟肾上腺素药物残留物的鉴别技术提供了一种快速、高效的新方法。

关键词:薄层色谱;表面增强共振拉曼光谱法;兽药残留

Analysis of Residues of Salbutamol Sulfate in Animal Food Based on TLC-SERRS

CAO Meng, XU Feng*, ZHANG Honglian, LIANG Xin, XU Tao, LI Qian

(School of Pharmacy, Qiqihar Medical University, Qiqihar 161006, China)

Abstract: Objective: To establish a method for the detection of phenethylamine-like adrenaline-like salbutamol sulfate residues by TLC and surface enhanced resonance Raman spectroscopy. Method: The surface strengthening agent silver sol was prepared from silver nitrate and sodium citrate by microwave heating method. The parameters of the prepared silver sol were determined, and the silver sol with better surface enhancement effect was selected. When salbutamol sulfate was detected by surface-to-enhanced resonance Raman spectroscopy, aromatic diazo salt and surface enhancer silver sol were added to the target spots isolated from TLC plate, and then the Raman spectra were detected. Result: This method can significantly enhance the detection signal of Raman spectrum, and the enhancement factor can reach 1.65×107. Conclusion: This method has strong specificity and good durability, and provides a rapid and efficient new method for the identification of phenethylamines and adrenergic drug residues.

Keywords: thin layer chromatography; surface enhanced resonance Raman spectroscopy; veterinary drug residue

硫酸沙丁胺醇,又称硫酸舒瑞灵,主要用于呼吸道疾病的治疗[1]。此外,硫酸沙丁胺醇属于苯乙胺类拟肾上腺素药物,具有增加瘦肉率、降低骨骼及脂肪含量的功效,常被添加在动物饲料中。若人们长期摄入含此类药物的动物性食品,将会对身体健康产生极大的影响,具体表现为肌肉震颤、恶心呕吐、心慌头痛等症状,且对于有高血压、甲状腺功能亢进、心脏病、糖尿病患者,还会加重患者原本的病情,严重者会导致死亡[2]。所以,农业农村部等相关部门,先后下发文件禁止在动物饲料中非法添加此类物质,并严格规定了食品中兽药的最大残留量。薄层色谱(Thin Layer Chromatography,TLC)法可以快速、高效地对微量物质进行分离,是最简单的色谱技术之一,但易出现假阳性结果[3-4]。表面增强共振拉曼光谱(Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy,SERRS)对样品的制备要求不高且样品分析无须预处理。由于动物食品的成分复杂,本研究拟采用薄层色谱法进行快速初筛,再采用表面增强拉曼光谱法[5]进一步确认,建立动物食品中的苯乙胺类拟肾上腺素药物的TLC-SERRS检测新方法,为含有酚羟基的硫酸沙丁胺醇等药物的检测提供一定的理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

猪肝,市场随机购买5批猪肝样品,标号为S1~S5。

硫酸沙丁胺醇(100328-201804,100 mg),购自中国食品药品检定研究院;硝酸银,天津市东丽区天大化学试剂厂;柠檬酸钠和对氨基苯硫酚,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙酸乙酯,天津市天力化学试剂有限公司;甲醇,天津市富宇精细化工有限公司;冰醋酸,天津市奥普升化工有限公司。

DXRxi显微拉曼成像光谱仪(激光波长532 nm),Thermo Fisher Scientific;ZF-1S三用紫外灯,绍兴市苏珀仪器有限公司;Zetasizer Nano ZS90纳米粒度仪,英国马尔文仪器有限公司;60F254铝制薄层板,德国默克公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的制备

(1)对照品溶液的制备。精密称取硫酸沙丁胺醇对照品2 mg,用甲醇溶解稀释,配成1 mg·mL-1的对照品溶液,密闭保存备用。

(2)样品溶液的制备。取少量猪肝样品,搅碎。称量10.00 g猪肝于50 mL烧杯中,分3次加入

15 mL甲醇,超声15 min后,弃去滤渣,将猪肝溶液置于15 mL棕色离心管中,置离心机(4 000 r·min-1,5 min)离心沉降,取上清液,蒸发至2 mL得样品溶液,密闭保存备用。

(3)模拟阳性样品溶液的制备。采用HPLC法检测市售样品,筛选不含上述组分的样品作为阴性样品。按样品溶液的制备方法处理得阴性样品溶液。取阴性样品溶液适量,量取对照品适量加入其中,混匀,得到浓度为1 mg·mL-1的模拟阳性样品溶液,密闭保存备用。

1.2.2 银溶胶的制备

称取74.6 mg硝酸银溶于200 mL超纯水中,再称取0.2 g柠檬酸钠溶于20 mL超纯水中备用。取硝酸银溶液100 mL于250 mL玻璃瓶中,放入微波炉中加热至沸腾后取出,一次性加入1%柠檬酸钠

2.5 mL,混匀后继续加热2 min,冷却得2 min灰绿色银溶胶。同法加入柠檬酸钠后混匀加热1 min得

1 min灰绿色银溶胶。

1.2.3 芳香族重氮盐的制备

用移液枪吸取5 mL浓盐酸溶液,将30 mL超纯水加入其中,置于蓝盖瓶中,并加入1.800 5 g对氨基苯硫酚,溶解,倒入棕色蓝盖瓶中,得对氨基苯硫酚的稀盐酸溶液,备用。取1.720 6 g亚硝酸钠加入50 mL超纯水中,倒入另一蓝盖瓶中,得亚硝酸钠溶液,备用。取2 mL对氨基苯硫酚的稀盐酸溶液和2 mL亚硝酸钠溶液在冰盐浴(0~5 ℃)下反应,得黄色芳香重氮盐,用50% NaOH溶液调节pH值为8~10,搅拌5 min,得酒红色溶液,备用。

1.2.4 TLC-SERRS方法

以硅胶60F254铝制薄层板为固定相,乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(9∶l∶2,v∶v∶v)为展开剂,分别点对照品和样品各3 μL,采用滤纸条饱和法饱和10 min,再在室温下展开后取出,晾干,然后在254 nm紫外灯下检视各组分斑点。

在薄层中分离出的成分斑点上以及样品相同Rf值的位置,原位滴加4 μL芳香族重氮盐,使含有酚羟基的组分生成偶氮化合物,再滴加8 μL银溶胶。让显微成像拉曼光谱仪的光源直接对准TLC板的斑点原位采集拉曼光谱。拉曼光谱的采集条件为激发光源532 nm,采用10倍显微镜,540 μm图像像素,300~3 500 cm-1扫描范围,5.0 μm共聚焦针孔光阑。用区域点扫的扫描方式,10.0 mW激光功率,

0.050 00 s曝光时间,扫描25次。

1.2.5 数据统计

数据采集及分析软件用OMNICxi;制图软件用Origin 6.1。

2 结果与分析

2.1 银溶胶的选择

对两种加热时间不同的银溶胶进行参数测定,选择增强效果更好的银溶胶作为本研究的表面增强剂。首先使用Zetasizer Nano ZS90纳米粒度仪对银溶胶的粒径和电势进行测定。由图1、图2可知,1 min银溶胶的平均粒径为24.94 nm,2 min银溶胶的平均粒径为11.35 nm,可见微波法加热

2 min制备的银溶胶反应更充分,粒径更小。之后在紫外-可见光区的光谱下对两种银溶胶进行检测。由图3可知,1 min银溶胶的最大吸收波长为

424.8 nm,半峰宽(Full Width at Half Maxima,FWHM)为78.858;2 min银溶胶的最大吸收波长为424.0 nm,半峰宽为78.232。通常半峰宽仅与粒径分布有关,半峰宽窄则意味着粒径分布较小。由图3可知,两种银溶胶的半峰宽相近,说明两种银溶胶的粒径分布相似。最后测定两种银溶胶的电势,结果如图4、图5所示,即1 min银溶胶的Zeta电势为

-31.9 mV,2 min银溶胶的Zeta电势为-38.4 mV。可见微波法加热制备的两种银溶胶的Zeta电势绝对值都大于30 mV,稳定性均较好。

图1 1 min银溶胶的粒径图

图2 2 min银溶胶的粒径图

由于两种银溶胶的相关参数(粒径、半峰宽和Zeta电势)均较好,可选择使用拉曼光谱检测技术进一步判定。按方法“1.2.4”进行拉曼光谱测定,在空白硅胶薄层板上测两种银溶胶的背景,然后在空白位置滴加8 μL吡啶,测其拉曼光谱信号,之后分别滴加两种银溶胶各4 μL,测得其拉曼光谱信号,所得结果如图6所示,以吡啶1 030 cm-1峰为内标峰,可以计算出这两种金属溶胶的增强因子。增强因子越大,则增强效果越好。增强因子的计算公式为

Ef =(ISERS×NNRS)/(NSERS×INRS),其中ISERS和INRS分别为样品的SERS强度和正常拉曼光谱强度,NSERS和NNRS分别为表面样品中和正常样品中参与散射的分子数。经计算,两种银溶胶的增强因子分别为

Ef (1 min)=2.79×107,Ef (2 min)=8.62×107。因此,2 min银溶胶的增强效果比1 min银溶胶的增强效果好。综上所述,本研究选择2 min银溶胶作为表面增强剂。

图3 1 min银溶胶及2 min银溶胶的紫外-可见光谱图

图4 1 min银溶胶的电势图

图5 2 min银溶胶的电势图

2.2 专属性考察

为了考察样品中的其他组分是否对目标组分的检出有影响,进行了专属性考察,并对组分斑点进行确认。参考1.2.4操作,分别取硫酸沙丁胺醇对照品溶液、阴性样品溶液、模拟阳性样品溶液各3 μL点于同一块TLC板上,进行TLC展开后在254 nm紫外灯下检视各组分斑点。由图7可知,模拟阳性样品斑点的位置与对照品斑点相同,阴性样品虽有斑点,但与模拟阳性样品斑点及对照品斑点不在同一比移值处,所以对照品溶液可与它的其他辅料等成分进行初步分离,也表明乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(9∶l∶2,v∶v∶v)展开体系的展开效果较好,斑点比移值为0.24,符合2020版《中华人民共和国药典》规定的比移值(0.2~0.8)。

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