高效液相色谱-示差折光检测法测定果冻中三氯蔗糖含量的不确定度评定

摘 要：目的：评定基于高效液相色谱-示差折光检测法测定果冻中三氯蔗糖含量的不确定度。方法：参照《食品安全国家标准 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》（GB 22255—2014）进行实验，基于《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS—GL06：2019）中不确定度的评估程序，对果冻中三氯蔗糖含量测定的不确定度进行量化分析。结果：果冻中三氯蔗糖的含量为0.048 4 μg·kg-1，在95%置信水平上的扩展不确定度为0.005 0 μg·kg-1（k=2）。结论：测定结果不确定度的主要来源为测量重复性、高效液相色谱仪和标准物质浓度。

关键词：高效液相色谱法；果冻；三氯蔗糖；不确定度

Evaluation of Uncertainty in the Determination of Sucralose in Jelly by High Performance Liquid Chromatography-Refractive Index Detection

LI Yong

（Shantou Inspection and Testing Center， Shantou 515041， China）

Abstract： Objective： To evaluate the uncertainty of the determination of sucralose content in jelly using high performance liquid chromatography-refractive index detection method. Method： Based on the uncertainty evaluation procedure in CNAS—GL06：2019， the uncertainty in the determination of sucralose content in jelly was quantitatively analyzed by referring to GB 22255—2014 for experiments. Result： The content of sucralose in the jelly is 0.048 4 μg·kg-1， with an expanded uncertainty of 0.005 0 μg·kg-1 （k=2） at a 95% confidence level. Conclusion： The main sources of uncertainty in measurement results are measurement repeatability， high-performance liquid chromatography， and standard substance concentration.

Keywords： high performance liquid chromatography-refractive index detection; jelly; sucralose; uncertainty

果冻是一种深受消费者特别是儿童喜爱的休闲食品，具有独特的口感和风味。随着果冻工艺的进步，传统果冻慢慢衍生出功能型、保健型等种类多样化的果冻，以满足现代人健康饮食的需求。在果冻的制作过程中，添加适量的甜味剂等食品添加剂可使果冻获得独特的风味[1]。三氯蔗糖（Sucralose，SUC）是一种低热量的高强度甜味剂，其甜度约为蔗糖的600倍，在全球范围内被广泛用于多种食品和饮料中[2-3]。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[4]允许果冻中添加SUC，最大使用量为0.45 g·kg-1。事实上，SUC的测定是检验检测机构资质认定的常规项目，其检测结果的不确定度是评定可靠性的重要依据。《检验检测机构资质认定能力评价 检验检测结构通用要求》（RB/T 214—2017）中明确规定，当检测结果出现临界值等情况时需要给出测量不确定度[5]。

本文按照《食品安全国家标准 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》（GB 22255—2014）[6]对果冻中SUC的含量进行测定，并依据《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS-GL06：2019）[7]对测量结果进行不确定度分析，评估各类不确定度因素来源的贡献率，为提升检测结果质量水平提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

BS224S电子天平；Multi Reax涡旋振荡器；TGL-16M高速台式冷冻离心机；YDCY-36SL电动圆形水浴氮吹仪；LC-20AT高效液相色谱仪（配有示差折光率检测器）。

SUC标准物质（质量浓度20 000 μg·mL-1，不确定度±5%）；乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；本实验中其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

准确称取捣碎混匀的果冻2.00 g，参照

GB 22255—2014制备待测液上机测试。进行加标实验时，在捣碎混匀的果冻中加入合适体积的SUC标准物质，同样参照GB 22255—2014制备待测液。

1.2.2 标准工作液的配制

用纯水作为溶剂，将SUC标准溶液逐级稀释成浓度为10.0 mg·mL-1和1.00 mg·mL-1的标准中间液。使用纯水作为溶剂，逐级稀释1.00 mg·mL-1的SUC标准工作液，配制成浓度分别为0.40 mg·mL-1、

0.20 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、

0.02 mg·mL-1的SUC标准工作液。

1.2.3 仪器条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，

5 μm）；流动相：水/乙腈（89/11，V/V）；流速：

1.0 mL·min-1；进样量：20 μL；柱温：35 ℃；示差检测器条件：检测池温度35 ℃，灵敏度16。

1.3 数学模型的建立

根据测定的方法原理，果冻中SUC含量的计算公式为

（1）

式中：X为果冻中SUC的含量，g·kg-1；c为果冻待测液中SUC浓度，mg·mL-1；c0为空白待测液中SUC浓度，mg·mL-1；V为果冻待测液体积，mL；

m为果冻质量，g；R为回收率校正因子，%。

2 结果与分析

2.1 测量不确定度来源分析

根据SUC的分析测试原理和过程，使用HPLC测量果冻中SUC含量的不确定度来源包括SUC标准溶液浓度、标准中间液配制过程、标准工作液配制过程、校准曲线的线性拟合、样品称量、样品前处理、高效液相色谱仪、回收率校正因子以及测量重复性等因素。其中，标准中间液配制、标准工作液配制和样品待测液制备中所涉及使用吸量管和容量瓶以及计量器具因温度导致体积变化引入的不确定度，统一归到体积引入的不确定度中。具体不确定来源分析如图1所示。

图1 果冻中SUC含量测定的不确定度来源分析

2.2 测量不确定度的评定

2.2.1 标准物质浓度引入的相对标准不确定度urel（c）

（1）标准物质纯度引入的相对标准不确定度urel（c1）。通过查询标准物质证书，实验所用SUC的标准溶液浓度cs=2 000 μg·mL-1，相对扩展不确定度Urel（cs）=±5%，在95%置信水平上的包含因子k=2，按B类不确定度评定，由SUC标准物质纯度引入的urel（c1）为

（2）标准溶液浓度由温度变动引入的相对标准不确定度urel（c2）。市购SUC标准物质溶剂为纯水，实验温度变动范围为（20±5）℃，20 ℃时膨胀系数α1=2.1×10-4 ℃-1，假设温度变动符合矩形分布，包含因子。按B类不确定度评定，由温度变动引入的urel（c2）为

则标准物质浓度引入的相对标准不确定度urel（c）为

2.2.2 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel（sc）

根据GB 22255—2014，本实验配制了5个浓度的SUC工作液。经线性拟合，得到方程y=ax+b=

375 161.542x-1 278.577，相关系数R=0.999 89，测试结果如表1所示。

经测试，空白溶液未检出SUC。经加标实验，对果冻样品待测液中SUC进行3次平行测试（p=3），测试浓度分别为0.100 68 mg·mL-1、0.100 36 mg·mL-1和

0.100 97 mg·mL-1，求得平均浓度x0=0.100 67 mg·mL-1。

按A类不确定度评定，由标准曲线拟合引入的urel（sc）计算公式为

（2）

（3）

式中：S为峰面积残差的标准偏差，经计算S=986.047；n为校准点的个数；xi为第i个校准点的质量浓度，mg·mL-1；x为5个校准点配制浓度的平均值，mg·mL-1；yi为第i个SUC校准点色谱峰的峰面积；a为斜率；b为截距；p为平行测定次数。

通过计算可知，u（sc）=1.973 0×10-3 mg·mL-1，则其相对标准不确定度urel（sc）为

2.2.3 体积引入的相对标准不确定度urel（V）

标准中间液配制、标准工作液配制、样品前处理过程中使用计量器具涉及体积引入的不确定度，按B类不确定度评定，包括3部分：计量器具校准、温度变化、重复性测定。其中，重复性测定归入整个实验过程中测量重复性引入的不确定度分析中。

（1）计量器具校准引入的相对标准不确定度urel（V1）。计量器具校准引入的不确定度按B类不确定度评定。计量器具的容量允差数据参考《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）。吸量管按矩形分布处理；容量瓶按三角形分布处理。各个不同来源的相对标准不确定度计算结果如表2所示。

根据表2的结果，计算得到计量器具校准引入的相对标准不确定度urel（V1）为

（2）温度变化引入的相对标准不确定度urel（V2）。由温度变化对体积的影响引入的不确定度按B类不确定度评定。在实验温度下，溶液膨胀效应显著性大于计量器具的膨胀效应，故只考虑由溶液膨胀效应引入的不确定度。依据CNAS—GL006：2019，实验室温度在±5 ℃变动，温度变化按矩形分布处理，包含因子为。水的体积膨胀系数为α2=2.1×10-4 ℃-1，相对标准不确定度为；有机液体的体积膨胀系数为α3=1.0×10-4 ℃-1，待测液制备的溶剂主要为水，引入的相对标准不确定度用水的体积膨胀系数进行计算。各个不同来源的相对标准不确定度如表3所示。

根据表3计算得到由温度变化引入的urel（V2）为

计量器具校准和温度变化引入的不确定度互不相关，合成得到体积引入的urel（V）为

2.2.4 果冻样品质量称量引入的相对标准不确定度urel（m）

称量果冻样品过程引入的不确定度按B类评定，其不确定度来源包括3个部分：电子天平校准、电子天平分辨力和称量时随机变化。其中，称量时随机变化引入的不确定度囊括到测量重复性引入的不确定度分析中。