二维液相色谱法对特殊医学用途配方食品中维生素A、D、E含量的检测

摘 要：特殊医学用途配方食品的基质较为复杂，且目标物含量较低，因此对其中维生素准确定量具有较大难度。本方法采用了一个同时测定维生素A、D、E的稳定高效的在线固相萃取-二维液相色谱方法。本方法利用SPE柱净化皂化液，通过六通阀的转化后注入一维色谱柱进行洗脱分离，利用阀切换模式进入二维系统再次分离。该方法的测定结果与国标方法基本一致，方法学满足国标要求。本方法采用三泵两个检测器，实现了皂化液定容后直接上样测定，简化了前处理步骤，提高了分析效率，对环境更友好。

关键词：二维液相色谱法；特殊医学用途配方食品；维生素A、D、E；含量测定

Detection of Vitamin A， D， E Content in Special Medical Formula Foods Using Two-Dimensional Liquid Chromatography

DAI Xiaohui

（Guangdong Yantang Dairy Industry Co.， Ltd.， Guangzhou 510700， China）

Abstract： The matrix of formula foods for special medical purposes is relatively complex and the target content is low， making it difficult to accurately quantify the vitamins in them. This method adopts a stable and efficient online solid-phase extraction two-dimensional liquid chromatography method for the simultaneous determination of vitamins A， D， and E. This method uses an SPE column to purify the saponified solution， which is converted through a six way valve and injected into a one-dimensional chromatographic column for elution and separation. The valve switching mode is used to enter a two-dimensional system for further separation. The measurement results of this method are basically consistent with the national standard method， and the methodology meets the requirements of the national standard. This method uses three pumps and two detectors to directly sample and determine the saponification solution after constant volume， simplifying the pre-treatment steps， improving analytical efficiency， and being more environmentally friendly.

Keywords： two dimensional liquid chromatography; formulated foods for special medical purposes; vitamins A， D， E; content determination

特殊医学用途配方是为满足饮食受限、消化吸收不良、新陈代谢失衡或特定疾病患者需求专门加工制备而成的一类营养食品，具体包括辅助营养支持、预防营养不良、特殊疾病或功能状态治疗等多种类型[1]。特殊医学用途配方食品主要以维生素、蛋白质、脂肪、矿物质和碳水化合物五大类为营养指标，其中维生素A、D、E是非常关键的营养素。特殊医学用途配方食品的基质较为复杂，且目标物含量较低[2-3]。因此对其中维生素准确定量具有较大难度。本课题所构建的全自动在线二维色谱分析平台及样品前处理过程，基于一法多用的策略，从方法的普适性、耐用性和法规依从性，可拓展至其他待测物的定量分析中。目前仅研究开发食品中的维生素A、D、E的检测，将来还可针对保健食品和药品中脂溶性维生素的检测方法做进一步开发

研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

维生素C，国药集团化学试剂有限公司；2，6二叔丁基对甲酚（纯度＞99.0%），国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钾（优级纯），国药集团化学试剂有限公司；甲基叔丁基醚（色谱纯），国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈与乙醇（色谱纯），云南新蓝景化学工业有限公司；特殊医学用途配方食品原料（供试品），南京德瑞源医药科技有限公司。

1.2 实验仪器

液相色谱仪（1260 1D-VWD、1260 2D-DAD），Agilent Technologies公司；电子天平（BSA223S），Sartorlus Group公司；超纯水机（DZG-303A），富诗特仪器设备上海有限公司；涡旋混合器（美国SI Vortex-Genie 2），略申仪器设备上海有限公司；水浴恒温振荡器（SHZ-88A），上海精胜科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计（L8），上海仪电分析仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液配制

维生素C水溶液：准确称取抗坏血酸3.00 g，加入50 mL超纯水溶解。氢氧化钾溶液：准确称取500 g的氢氧化钾放入烧杯中，加入500 mL超纯水，用玻璃棒搅拌均匀，待其自然冷却后，转移至聚乙烯瓶中存储。BHT乙醇溶液：准确称取2，6二叔丁基对甲酚250 mg于聚乙烯瓶中，加入500 mL乙醇溶解，保持容器密封。1∶1乙醇溶液：准确量取500 mL无水乙醇，加入等体积的超纯水，转移至聚乙烯瓶中存储。维生素A标准品：视黄醇（C20H30O，CAS号：68-26-8），纯度＞99%，坛墨质检科技股份有限公司。维生素D标准品：胆钙化醇（C27H44O，CAS号：67-97-0），纯度＞99%，坛墨质检科技股份有限公司。维生素E标准品：α-生育酚（C29H50O2，CAS号：10191-41-0）：纯度为96%，坛墨质检科技股份有限公司。

维生素A标准储备溶液（0.500 mg·mL-1）：使用电子精密天平准确称取略大于10.0 mg视黄醇标准品于10 mL容量瓶中，先加入少量无水乙醇溶解后超声，待其完全溶解后用无水乙醇定容至刻度，纯度换算后补充相应体积的无水乙醇。得到每1 mL溶液中含有1 mg视黄醇标准品的储备溶液。使用移液管移取5 mL的储备液放入10 mL的容量瓶内，用无水乙醇稀释定容，涡匀后把溶液转移到棕色的试剂瓶内，贴上标签纸。得到浓度为0.500 mg·mL-1的对照品工作溶液。

维生素D3标准储备溶液（0.100 mg·mL-1）：使用电子精密天平准确称取略大于10.0 mg维生素D3标准品于10 mL容量瓶中，先加入少量无水乙醇溶解后超声，待其完全溶解后用无水乙醇定容至刻度，纯度换算后补充相应体积的无水乙醇。得到每1 mL溶液中含有1 mg维生素D3标准品的储备溶液。进一步得到浓度为0.100 mg·mL-1的对照品工作溶液。

维生素E标准储备溶液（1.000 mg·mL-1）：使用电子精密天平准确称取略大于10.0 mg α-生育酚标准品于10 mL容量瓶中，先加入少量无水乙醇溶解后超声，待其完全溶解后用无水乙醇定容至刻度，纯度换算后补充相应体积的无水乙醇。得到每1 mL溶液中含有1 mg α-生育酚标准品的储备溶液，此时该储备溶液浓度为1.000 mg·mL-1。

维生素A、D、E混合标准溶液中间液：分别准确移取维生素A、D3、E的标准储备溶液5.063 mL、539 μL、6.332 mL于同一25 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释并定容至刻度，获得维生素A、D、E的混合标准储备液。准确移取10 mL的混合标准储备液放入100 mL的容量瓶中，用无水乙醇稀释并定容至刻度。此溶液中维生素A浓度为10 μg·mL-1，维生素D浓度为0.2 μg·mL-1，维生素E浓度为25 μg·mL-1。

维生素A、D、E标准系列工作溶液：分别准确吸取上述的混合标准溶液中间液0.10 mL、0.20 mL、1.00 mL、5.00 mL、10.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇逐级稀释成以下浓度。该标准系列中维生素A浓度为0.100 μg·mL-1、0.200 μg·mL-1、

1.000 μg·mL-1、5.000 μg·mL-1、10.000 μg·mL-1，维生素D浓度为0.002 μg·mL-1、0.004 μg·mL-1、

0.020 μg·mL-1、0.100 μg·mL-1、0.200 μg·mL-1，维生素E浓度为0.250 μg·mL-1、0.500 μg·mL-1、2.500 μg·mL-1、12.500 μg·mL-1、25.000 μg·mL-1。临用前配制。

1.3.2 样品前处理

称取适量样品于50 mL容量瓶中，加入5 mL维生素C水溶液，5 mL氢氧化钾水溶液，10 mL BHT乙醇溶液。涡匀后放置到80 ℃水浴恒温振荡器中皂化40 min。将皂化后的样品迅速冷却至室温，然后用1∶1乙醇水（体积比）定容。溶液过3个0.22 μm有机系滤膜至棕色进样瓶中，即得供试品溶液，待测。

1.3.3 二维液相色谱条件

在线固相萃取柱：PLRP-S（4.6 mm×12.5 mm，15～20 μm），流动相：A相为水、B相为甲醇、C相为乙腈、D相为甲基叔丁基醚，以1.0 mL·min-1的流速进行梯度洗脱。捕获柱：Poroshell 120 EC-C18

（4.6 mm×5 mm，4 μm）。

一维色谱柱：Poroshell 120 PFP（4.6 mm×100 mm，

4 μm），流动相：A相为水、B相为甲醇，流速

0.5 mL·min-1，采用VWD检测器检测维生素A、E，波长分别为325 nm与294 nm，柱温保持为35 ℃。

二维色谱柱：Zorbax Eclipse Plus PAH

（2.1 mm×100 mm，3.5 μm），流动相：A相为乙腈、B相为甲醇，流速0.4 mL·min-1，采用DAD检测器检测维生素D3，波长为264 nm，柱温保持为35 ℃。梯度洗脱程序如表1、表2、表3所示。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

特殊医学用途配方食品的基质较为复杂，目标物含量比较低。烟酸、维生素B5、维生素B12、维生素B9等需要紫外检测的物质对其影响比较大，所以前处理需要进一步净化和富集。为了使4种维生素E的异构体能够得到有效分离，一维色谱柱分别比较了Poroshell 120 PFP柱、EC-C8柱和Poroshell 120 EC-C18柱。其中Poroshell 120 PFP柱能较好分离4种维生素E，其他色谱柱不能将β-维生素E、γ-维生素E有效分离。