高产共轭亚油酸的植物乳植杆菌YYS-99筛选及特性研究

摘 要：目的：筛选1株高产共轭亚油酸的乳酸菌应用于工业化生产。方法：采用光度计检测法测定实验室菌库中300株乳酸菌生物转化共轭亚油酸的能力，从中筛选1株产共轭亚油酸最优的乳酸菌，经形态学观察、生理生化实验、16S rRNA序列测定对该乳酸菌进行鉴定。采用牛津杯法，测定该乳酸菌对食源性致病菌的抑菌谱。通过体外模拟人工胃液和肠液环境，测定该乳酸菌在不同pH值胃液下的耐酸性和不同胆盐质量浓度肠液下的耐胆盐性。结果：在底物亚油酸浓度为0.5 mg·mL-1时（LA+MRS），成功筛选出1株转化生成共轭亚油酸的量显著高于其他菌株的乳酸菌，产量为205.4 μg·mL-1，转化率约为41.1%。该乳酸菌经鉴定为植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），命名为YYS-99。YYS-99对宋内氏志贺氏菌的抑菌圈直径最大，为（16.84±0.32）mm。在体外模拟人工不同pH值胃液和不同胆盐质量浓度肠液下，YYS-99均具有较高的活菌数和存活率。结论：本研究从菌库筛选出1株高产共轭亚油酸的植物乳植杆菌（YYS-99），其对食源性致病菌有明显的抑制作用，且对不同pH值下的胃液和不同质量浓度胆盐下的肠液均具有良好的耐受性。

关键词：筛选；共轭亚油酸；植物乳植杆菌；耐胃酸；耐胆盐

Screening and Characteristic Study of Lactiplantibacillus plantarum YYS-99 with High Yield of Conjugated Linoleic Acid

QIAO Ronggeng， SONG Guimei， ZHU Yongle， WU Qionglin， ZHAO Dazhou， XU Mei

（Xiamen Yuanzhidao Biotechnology Co.， Ltd.， Xiamen 361100， China）

Abstract： Objective： Screening out one lactic acid bacteria with high yield of conjugated linoleic acid and applying it to industrial production. Method： The ability of 300 strains of lactic acid bacteria in the laboratory microbial bank to biotransformation conjugated linoleic acid was measured by ultraviolet spectrophotometer detection method， and one strain of the best lactic acid bacteria producing conjugated linoleic acid was screened out. The lactic acid bacteria were identified by morphological observation， physiological and biochemical experiments and 16S rRNA sequencing. Then the Oxford cup method was used to determine the bacteriostatic spectrum of the lactic acid bacteria against foodborne pathogens. Finally， the acid resistance of the lactic acid bacteria under different pH values of gastric juice and the bile salt resistance under different bile salt mass concentrations of intestinal juice were determined by simulating the artificial gastric juice and intestinal juice environment in vitro. Result： When the concentration of substrate linoleic acid was 0.5 mg·mL-1 （LA+MRS）， one strain of lactic acid bacteria was successfully screened， and the amount of conjugated linoleic acid （CLA） produced by the transformation was significantly higher than that of other strains， which yield was 205.4 μg·mL-1， and the conversion rate was about 41.1%. The lactic acid bacteria was identified as Lactiplantibacillus plantarum and named YYS-99. The bacterial YYS-99 has the largest inhibitory zone diameter against Shigella sonnei， which is （16.84 ±0.32） mm. YYS-99 showed good viabilit and survival rate under different pH of artificial gastric fluid and different concentration of bile salt in intestinal fluid. Conclusion： In this study， a strain of Lactiplantibacillus plantarum YYS-99 with high yield of conjugated linoleic acid was screened from the microbial bank. It showed obvious inhibition against foodborne pathogenic bacteria， and showed good tolerance to gastric fluid under different pH and intestinal fluid under different mass concentration of bile salt.

Keywords： screen; conjugated linoleic acid; Lactiplantibacillus plantarum; gastric acid tolerance; bile salt tolerance

共轭亚油酸有提高人体抗氧化能力和免疫能力的功效，同时能调节血浆胆固醇的水平、预防动脉粥样硬化、促进脂类氧化降解等，在食品、保健品中具有广泛的应用潜力[1-2]。目前，利用微生物代谢合成共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid，CLA），尤以乳酸菌作为一种公认安全的微生物在CLA生物转化应用方面的研究最热。夏嘉祎等[3]以乳杆菌为研究对象，系统地探究了其生物转化CLA的规律，得出乳杆菌属中的大部分植物乳杆菌可生物转化CLA，筛选得到的植物乳杆菌CCFM241的CLA转化能力最高，转化率为16.35%；郭小婧等[4]指出以亚油酸（Linoleic Acid，LA）为底物，筛选出产CLA的乳酸菌以植物乳杆菌最多。此外，乳酸菌是人体肠道中的正常菌群，具有帮助消化、维持肠道微生态平衡、增强免疫力等生理功能[5]。综上，本文旨在得到1株高产共轭亚油酸的乳酸菌，为我国生产研发相关功能性食品提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

菌库保藏的乳酸菌分离自云南省、重庆市、贵州省等地的油坊油料、特色自制发酵食品中；所用培养基为MRS及LB培养基；CLA标准储备液

（10 mg·mL-1），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；异丙醇、正己烷，天津市大茂化学试剂厂；SW-CJ-1FD超净工作台，苏州净化设备有限公司；HC-3016R高速冷冻离心机，上海诚卫仪器有限公司；TC1000-G型PCR扩增仪，北京大龙仪器股份公司。

1.2 方法

1.2.1 高产共轭亚油酸的条件筛选

（1）标准工作液及培养基的配制。将表1中配制的不同浓度CLA标准工作液振荡30 s后静置

6 min，测定OD233 nm，以CLA标准工作液浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。培养基配制方法见表2。

（2）样品检测。依次取菌库中保藏的甘油菌，分别按2%的接种量接种至上述MRS培养基中，

37 ℃，180 r·min-1培养72 h，未接种液为空白对照，发酵液8 000 r·min-1离心10 min，收集上清液于干净离心管中，按照发酵液∶异丙醇∶正己烷为3∶3∶6（V∶V∶V）的比例混合，漩涡振荡混匀后，静置分层，转移上层的正己烷层于干净的储液瓶中，测定OD233 nm。

1.2.2 YYS-99的鉴定

（1）生理生化试验。追溯实验室菌种库中YYS-99的分离来源登记资料，然后以2%的接种量活化，180 r·min-1培养24 h后平板划线，培养24 h即得单菌落，进行革兰氏染色及过氧化氢酶试验。

（2）16S rRNA鉴定[6]。按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取菌株DNA，以基因DNA为模板进行16S rRNA的PCR扩增。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析检测后外送测序，用Blast软件在美国国家生物技术信息中心数据库中搜索近似序列，用Mega7.0软件构建系统发育树。

1.2.3 YYS-99对食源性致病菌的抑菌

采用牛津杯法[7]，分别取100 μL活菌数为

107 CFU·mL-1的大肠埃希氏菌（美国典型菌种保藏中心）、金黄色葡萄球菌（美国典型菌种保藏中心）、宋内氏志贺氏菌（中国医学细菌菌种保藏管理中心）于平板内，倒入适量加热熔化的LB固体培养基，摇晃均匀，待其冷却凝固后，在平板内以适当的间隔依次放入牛津杯，然后取YYS-99发酵液100 μL添加至牛津杯孔内，以MRS液体培养基做阴性对照，以乳酸链球菌素（Nisin）做阳性对照，每组3个平行。

1.2.4 YYS-99模拟胃液耐酸性和肠液耐胆盐试验[8]

（1）模拟胃液耐酸性试验。称取0.2 g NaCl与

0.35 g胃蛋白酶溶解于适量蒸馏水中，用1 mol·L-1盐酸分别调节pH值为1.5、2.5、3.5，分别转移到100 mL容量瓶中，并定容至刻度线，模拟人体胃液酸性环境。将YYS-99活化2代，以

1×109 CFU·mL-1的浓度按2%接种量分别接入上述不同pH值的模拟胃液中，37 ℃水浴0 h、2 h、4 h后倒板，每组3个平行，37 ℃培养24 h后统计活菌数。以培养0 h的活菌数为对照，存活率计算公式为

（1）

式中：A0为在不同pH值的模拟胃酸溶液中培养0 h的活菌数，lg CFU·mL-1；An为在不同pH值的模拟胃酸溶液中培养2 h、4 h的活菌数，lg CFU·mL-1（n=2、4）。

（2）模拟肠液耐胆盐试验。称取不同质量的猪胆盐，分别配制质量浓度为0.3%、0.5%、0.7%的胆盐溶液，模拟人体肠液胆盐环境。将YYS-99活化2代，以1×109 CFU·mL-1的浓度按2%接种量分别接入

0.3%、0.5%、0.7%质量浓度的胆盐溶液中，37 ℃水浴0 h、2 h、4 h后倒板，每组3个平行，37 ℃培养24 h后统计活菌数。以培养0 h的活菌数为对照，存活率计算公式为

（2）

式中：B0为在不同质量浓度的胆盐溶液中培养0 h的活菌数，lg CFU·mL-1；Bn为在不同质量浓度的胆盐溶液中培养2 h、4 h的活菌数，lg CFU·mL-1（n=2、4）。

1.2.5 统计学分析

使用SPSS软件进行数据处理，数值均用平均值±标准差表示，Duncan多重比较检验，以p＜0.05表示差异显著；使用Origin软件分析作图。