宠物食品中维生素B12的快速测定

摘 要：比较宠物食品中维生素B12检测方法的差别，并评价微孔板法检测维生素B12的检测性能。采用微孔板法与微生物法模拟样品与自然样品的检测试验，比较分析检测结果。微孔板法与微生物法的检测效果基本一致，微孔板法具有良好的检测性能。同时发现维生素B12的含量受加工工艺的影响较大，在高温膨化粮中的平均含量最低，仅为6.2 μg/100 g，而在冻干粮中的含量最高，达到16.0 μg/100 g。

关键词：宠物食品;维生素B12;微孔板法;快速测定

Rapid Determination of Vitamin B12 in Pet Food

HAN Ji1， SHI Lei1， LIANG Qimei1， TAO Wenjing2， ZHANG Junchao2， WANG Yuhua1*

（1.SGS-CSTC Standards Technical Services （Qingdao） Co.， Ltd.， Qingdao 266071， China; 2.Beijing Meizheng Bio-Tech Co.， Ltd.， Beijing 102200， China）

Abstract： The differences in the detection methods of vitamin B12 in pet food were compared，and the detection performance of microplate method for vitamin B12 detection was evaluated. Used the microplate method and microbiological method to carry out the detection experiments of the natural sample and the simulated sample respectively， compared and analyzed the results. The results of the microplate method and microbiological method are consistency. The test indicated the micro plate method has good detection performance. At the same time， it was found that the content of vitamin B12 was greatly affected by the processing technology. The average content of vitamin B12 in high-temperature puffed pet foods was the lowest， only 6.2 μg/100 g， while the content in freeze-dried pet foods was the highest， reaching

16.0 μg/100 g.

Keywords： pet food; vitamin B12; microplate method; rapid determination

近年来，随着经济的发展，我国的宠物行业快速崛起，宠物食品的需求量也日益增加，近十年我国宠物食品的平均增长率为25%[1]。宠物食品指的是根据宠物的整个生理周期、宠物的品种和需要的营养而专门为宠物研发的营养均衡的食品[2]。目前，狗粮和猫粮是最具有经济价值、规模和市场运作能力的主要宠物食品[3]。根据形态不同，可以将宠物食品分为干性宠物食品、湿性宠物食品和半干性宠物食品三大类[4]。我国宠物食品行业起步较晚，宠物营养管理方面的法规和标准并不完善。目前，行业内公认的三大营养标准包括美国饲料管理协会、美国国家研究委员会以及欧盟饲料行业协会的标准[5]。国内企业为满足消费者的需要及出口需求，宠物食品中的营养成分会按照相应的美国饲料管理协会或欧盟饲料行业协会标准进行添加。

维生素B12（钴胺素）是一种重要的维生素，在保持宠物健康方面发挥着一些特殊作用。维生素B12对于维持神经系统和细胞生长至关重要，同时在造血、改善大脑功能和维持良好的肠道健康方面也起着关键作用[6]。目前，对于维生素B12的检测主要集中于功能饮料[7]、保健食品[8]、配方奶粉[9]和血清[10]等领域，对于宠物食品中的维生素B12的检测鲜有报道。根据美国饲料管理协会的要求，犬粮中维生素B12的最低含量为2.8 μg/100 g，猫粮中维生素B12的最低含量为2.0 μg/100 g[5]。而欧盟饲料行业协会中规定，维生素B12在生长和繁育期犬粮和猫粮中的含量不得低于2.8 μg/100 g和1.8 μg/100 g，在成年期犬粮和猫粮中不得低于3.87 μg/100 g和2.35 μg/100 g。维生素B12的常用检测方法包括HPLC法、HPLC-MS法、酶联免疫法和微生物法[11]，由于宠物食品的基质复杂且维生素B12的含量较低，微生物法是较为合适的选择，该方法虽然灵敏度较高，但由于操作烦琐，检测周期长，重复性差而不能被广泛应用。本研究拟对维生素B12的微生物测定法进行优化，将试管法改进为96孔微孔板法，对宠物食品中维生素B12的测定进行相关评价试验，以期为宠物食品中维生素B12的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

AL204-IC电子天平，梅特勒托利多科技（中国）有限公司;LRH-250生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司;VORTEX3涡旋振荡器，德国IKA;HWS-28电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司;DL-CJ-2ND洁净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司;ELX808酶标仪，美国BioTek;维生素B12检测试剂盒，北京美正生物科技有限公司;莱士曼氏乳酸杆菌，美国典型菌种保藏中心，ATCC7830;维生素B12标准品，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH。

1.2 试验用样品的制备

选取9份不含有维生素B12的宠物食品样品，包括3份全价猫粮基底、3份全价犬粮基底和3份成猫主食罐基底。人工添加维生素B12标准品至9批样品中，使维生素B12含量分别为1.0 μg/100 g、5.0 μg/100 g和10.0 μg/100 g。

1.3 样品的前处理

称取1.0 g均质后的样品，将其加入50 mL无菌离心管中，加入40 mL去离子水，在95 ℃水浴中提取30 min，每隔10 min混匀1次（确保离心管密封），然后快速冷却至30 ℃以下。用0.22 μm无菌滤膜过滤取滤液。根据维生素B12的浓度范围，在2 mL无菌离心管中使用无菌水对滤液进一步稀释。

1.4 微孔板法检测

1.4.1 配制维生素B12标准品

打开标准品瓶盖，取2.8 mL无菌水加入标准品瓶中，盖上瓶盖，振荡使标准品充分溶解，即为标准品工作液。取6个2 mL无菌离心管，将标准品工作液分别稀释成0 μg/100 g、0.03 μg/100 g、0.06 μg/100 g、0.09 μg/100 g、0.12 μg/100 g和0.18 μg/100 g。

1.4.2 检测菌液的制备

向维生素B12培养基瓶中加入10 mL无菌水，盖紧瓶盖，振荡溶解。保证瓶盖密闭的前提下，95 ℃水浴加热5 min，然后快速冷却至室温（低于30 ℃）。使用0.22 μm无菌滤膜过滤全部培养基，用15 mL无菌离心管收集全部滤液。向冻干菌株瓶内加入1 mL无菌水，用移液枪吹打混匀，取其中的0.9 mL加入过滤后的培养基中，振荡混匀，即为检测菌液。

1.4.3 检测步骤

取出所需数量的微孔条置于微孔架上，依次将140 μL标准品或样品、140 μL检测菌液加入微孔中，然后用粘胶薄膜盖好微孔条，在37 ℃培养箱中避光孵育44～48 h。培养完成后，轻轻来回颠倒混匀微孔板，使菌液充分混匀，然后用一只手将微孔条固定于微孔架上，另一只手自右上方沿对角揭开粘胶薄膜，静置2 min待气泡全部消去后用酶标仪在610～630 nm下测量浑浊度，使用四参数法进行结果计算。

1.5 微生物法与微孔板法的比较

分别使用国家标准《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》（GB 5413.14—2010）与微孔板法对表1中所列9种宠物食品中的维生素B12进行测定，将这两种方法的检测结果进行比较研究，包括回收率分析及线性分析。

1.6 宠物食品样品检测

宠物食品分为湿粮和干粮两大类，根据产品形态不同，干粮可分为高温膨化粮、低温烘焙粮、冻干粮和风干粮等，湿粮可分为罐头和鲜食等。据此，选择各品类共37个样品，分别使用微孔板法与微生物法进行检测，对检测结果进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 加标试验回收率分析

分别使用微孔板法和微生物法对表1所列9份宠物食品样品进行维生素B12的测定，计算各浓度水平的回收率，结果见表1。微生物法的回收率为94.0%～106.0%，而微孔板法的回收率稍低于微生物法，为93.0%～97.0%，回收率均能达到90%以上。

2.2 自然样品的检测结果

选择各品类共37个样品，分别使用微孔板法与微生物法进行检测，结果见表2。对两种方法的结果进行显著性差异分析，单因素方差分析结果显示F

3 结论与讨论

目前，微生物法是美国分析化学家协会和美国药典检测维生素B12的首选方法，但该方法操作烦琐，影响结果的因素多，对测试人员的要求高。微孔板法的原理与微生物法基本一致，但极大程度上简化了操作流程，减少了菌种在保存传代中发生污染可能性，数据处理操作简便。针对宠物食品特殊基质，进一步优化了提取流程，缩短检验周期，同时也减少了试验过程中因操作步骤烦琐引起的误差，与微生物法相比，具备良好的稳定性与准确性。

宠物食品主粮产品分为干粮和湿粮两类。干粮主要特征是水分含量少、表面干燥、颗粒状，包括膨化粮、烘焙粮、风干粮和冻干粮等多种产品形态。湿粮主要是糊状、水分含量高，主要有罐头和鲜食两种形态。徐坤等[12]研究发现，宠物食品在挤压膨化、制粒及贮存过程中，各种维生素随着温度或时间的变化都有一定程度的损失。经挤压加工后，宠物食品中脂类的氧化作用产生的氢过氧化物、过氧化物和环过氧化物等会引起维生素A、E等的氧化产生过氧化物，与活性的羰基反应造成维生素B6等的破坏，糖类非酶褐变产生的高度活化的羰基对维生素同样具有破坏作用。王红英等[13]以维生素C为例，对制粒过程中的调质温度、蒸汽压力、喂料器的给料速度等因素进行了试验研究，提出了影响维生素稳定性的主要因素是调质温度和蒸汽压力。葛建东等[14]也发现在制粒时调质用的蒸汽、高温以及挤压所造成的摩擦都是破坏维生素的主要因素。膨化的调质温度和压力都高于制粒，破坏性更大，膨化时加入大量的水分也是一个重要影响因素。本研究测试了主要品类的猫粮及犬粮中的维生素B12，结果表明，维生素B12在冻干猫粮中的平均含量最高，达到16.0 μg/100 g，而在高温膨化粮中的平均含量最低，仅为6.2 μg/100 g。需要说明的是，宠物罐头及鲜食虽然维生素B12的平均含量更低，但由于其含水量高达70%～90%，因此折算干基后维生素B12含量更高。

随着养宠渗透率的提升，并受益于宠物主对科学喂养理念的科普与产品认知的提高，越来越多的养宠人逐渐重视宠物的营养健康，国产宠物食品企业正在快速进阶，相关部门也应当加大监管力度，并制定相关检测标准和法规，促进我国宠物食品行业健康发展。