液相色谱-质谱/质谱法法测定禽畜肉中氯霉素类兽药残留量

摘 要：目的：本实验建立了一种基于高效液相色谱-质谱/质谱法同时测定禽畜肉中4种酰胺醇类药物残留的方法。方法：测试样品经过乙腈提取，环己烷脱脂，以甲醇和水为流动相梯度洗脱，采用电喷雾电离模式，多反应监测模式进行采集，内标法定量。结果：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在0.5～200.0 ng·mL-1线性关系良好，相关系数大于0.995，加标回收率在88.45%～112.45%，RSD在1.86%～8.04%。结论：该方法快捷、简便、回收率高，可用于禽畜肉中4种氯霉素类药物及其代谢物的测定。

关键词：氯霉素;液相色谱-串联质谱法;兽药残留

Determination of Chloram Phenicols Veterinary Drug Residues in Poultry and Livestock Meat by LC-MS/MS

WANG Wenpeng， WANG Tao， WANG Nana， LI Li

（Yan’an Center of Food Quality and Safety Control， Yan’an 716000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for simultaneous determination of 4 amide alcohol antibiotics residues in poultry and livestock meat based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Method： The test sample was extracted with acetonitrile， degreased with cyclohexane， eluted with methanol and water as mobile phase gradient， collected by electrospray ionization mode， multiple reaction monitoring mode， and quantified by internal standard method. Result： Chloramphenicol， thiamphenicol， florfenicol and florfenicolamide had a good linear relationship in the range of 0～200 ng·mL-1， and the correlation coefficient was greater than 0.995. The recovery rate of standard addition was between 88.45%～112.45%， and the RSD is between 1.86%～8.04%. Conclusion： The method is fast， simple and high in recovery rate， and can be used for the determination of four chloram phenicols drugs and their metabolites in poultry and livestock meat.

Keywords： chloramphenicol; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; residues of veterinary drugs

酰胺醇类抗生素主要有氯霉素、甲砜霉素及氟苯尼考，其中氯霉素是其代表性药物，因此也常被称为氯霉素类抗生素。氯霉素对多数革兰阴性菌和革兰阳性菌都有抑制作用，抗菌谱广，价格相对低廉，常被用于禽畜产品、水产品的养殖过程中[1]。但由于其严重的毒副作用，近年来美国、欧盟及中国等已禁止应用于动物疾病防治，规定在动物源性食品中不得检出[2]。而其同类物甲砜霉素、氟苯尼考在《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）中都有规定，其中甲砜霉素的ADI为0～5 μg·kg-1，在牛、羊、猪、家禽和鱼的各种可食组织中最大残留量为50 μg·kg-1;氟苯尼考的ADI为0～3 μg·kg-1，在牛、羊的肌肉组织中最大残留量为200 μg·kg-1，在其肝脏组织中为3 000 μg·kg-1，在其他动物食品的不同组织中各有不同。氟苯尼考胺作为氟苯尼考主要的代谢产物，其最大残留量要计入氟苯尼考[3]。但目前其检测标准不同，且同时测定食品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的方法较少[4-6]。本文参考相关标准和文献建立了一种同时测定4种酰氨醇类抗生素的方法[7-10]。

1 材料与方法

1.1 材料

猪肉、鸡肉、牛肉，采购自市场。取肌肉组织将其切碎，充分混匀，直接放入组织捣碎机中捣碎成匀浆，放入聚乙烯瓶中，-18 ℃冷冻保存。

1.2 试剂

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺和氯霉素-D5（100 μg·mL-1）（由坛墨质检提供）;乙腈、甲醇、甲酸、乙酸铵（色谱纯，默克试剂）;无水硫酸镁、无水乙酸钠（分析纯，国药试剂）;所用氮气、氩气浓度大于99.99%。

1.3 仪器与设备

LCMS8040三重四极杆液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI源），日本岛津;离心机：转速≥10 000 r·min-1，Sigama;涡旋混合器：IKA;电子天平（感量为0.001 g）：梅特勒;氮吹浓缩仪：莱伯泰科;具塞离心管：50 mL和15 mL，康宁。

1.4 试样的制备及方法

1.4.1 试样制备

称取解冻后试样5 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加100 µL氯霉素-D5内标（0.1 µg·mL-1）工作液和15 mL 2%氨水乙腈溶液，涡旋振荡15 min，超声提取15 min，8 000 r·min-1离心5 min。将上清液移入100 mL分液漏斗中，加15 mL乙腈饱和的正己烷脱脂。残渣中再加入10 mL 2%氨水乙腈溶液，重复一次，取上清液转移至同一分液漏斗。转移乙腈层至50 mL离心管中，离心，取上层清液，氮气吹干。加入1 mL水，振荡2 min，超声3 min复溶，取下层过0.22 μm微孔滤膜，供超高效液相色谱-串联质谱测定。空白基质的制备与样品制备过程相同。

1.4.2 标准溶液的配制

分别精密量取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺4种标准溶液（100 μg·mL-1）各0.2 mL，置于同一20 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度均为1 μg·mL-1的混合标准中间液，精密量取1 mL内标中间液于10 mL容量瓶，用甲醇稀释成100 ng·mL-1的混合标准使用液。

精密量取氯霉素-D5标准溶液（100 μg·mL-1）0.2 mL，置于另一20 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度均为1 μg·mL-1的内标中间液，精密量取1 mL内标中间液于10 mL容量瓶，用甲醇稀释成100 ng·mL-1的内标使用液。

取空白样品9份，按照1.4.1的处理过程，在氮气吹干之前加入适量标准使用液和100 µL氯霉素-D5内标（100 ng·mL-1），用1 mL 10%甲醇水复溶，制成0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1和200.0 ng·mL-1系列浓度，含内标10.0 ng·mL-1。

1.5 仪器条件

1.5.1 参考液相色谱条件

色谱柱：C18柱[150 mm×2.1 mm（内径），1.7 μm]，菲罗门（Phenomenex）;流动相：A-甲醇;B-水溶液;梯度洗脱程序见表1;柱温箱：40 ℃;进样量：10 μL;流速：0.30 mL·min-1。

1.5.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI），其中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素-D5为负模式，氟苯尼考胺为正模式;离子源接口电压：4.5 kV;雾化气：氮气2.0 L·min-1;干燥气：氮气15 L·min-1;碰撞气：氩气;DL温度：250 ℃;加热模块温度：400 ℃;扫描模式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）;驻留时间：100 ms;延迟时间：3 ms。MRM参数见表2。

2 结果与分析

2.1 条件优化与选择

动物源食品中氯霉素的检测，主要有气相色谱-质谱和液相色谱-质谱两种检测方法，文献中同时检测氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺多种药物的方法一般是液相色谱-质谱法，大部分是检测其中2～3种[4-6]。通过测试，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺需要用内标法定量，因其样品的制备过程中损失较多，这与文献报道基本一致[7-9]。本研究比较了乙酸乙酯和乙腈等多种提取手段，发现乙酸乙酯提取脂肪较多，而2%氨水乙腈提取效果较好，能满足实验要求。文献中常用流动相为乙腈-水体系或甲醇-水体系[9-10]，也有添加氨水的文献报道[7]，经过测试，甲醇和水的体系就能达到较好的分离效果，因此本文选用甲醇-水体系，和现行有效国家标准一致。

2.2 线性关系与检出限

以各组分的定量离子峰面积与氯霉素-D5内标峰面积的比例为纵坐标（y），相应的质量浓度为横坐标（x）进行线性回归，绘制标准曲线。结果表明，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在0.5～200.0 ng·mL-1有良好的线性关系，相关系数均大于0.995，线性方程和相关系数见表3。取牛肉阴性样品，添加0.1 mg·kg-1混合标准溶液，加入标准混合液，以3倍信噪比法计算的检出限在0.022～0.120 μg·kg-1。

2.3 加标回收率和重复性

取牛肉阴性样品，添加0.1 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-13个浓度水平的混合标准溶液，进行加标回收试验，其余操作同1.4.1样品制备，每个浓度平均测定6次，计算回收率和重现性（以相对标准偏差表示）。结果显示，样品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的平均回收率在88.45%～112.45%，相对标准偏差RSD为1.86%～8.04%，具体结果见表4。结果表明，该方法回收率高、稳定性好，适用于牛肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的测定。同时对猪肉和鸡肉测试，得到相似的结论。

3 结论

本研究通过对牛肉、鸡肉和猪肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的分析测试，建立了高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中禽畜肉中4种氯霉素类药物残留的方法，并从线性关系、回收率、重复性和检出限等方面进行了考察。结果表明，该方法快捷、简便、回收率高，可用于禽畜肉中4种氯霉素类药物及其代谢物的测定，为研究同时测定动物源性食品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的残留提供了参考依据。

参考文献

[1]黄鸾玉，吴祥庆，韦信贤，等.酰胺醇类混合标准溶液的稳定性研究[J].化学试剂，2020，42（12）：1475-1479.

[2]王自良，赵坤，张改平.氯霉素的毒性及其在动物性食品中的残留与检测[J].河南科技学院学报（自然科学版），2005（2）：101-105.