生乳中的安全风险及胶体金免疫层析技术在检测中的应用

1.引言

牛乳所含的营养素全面，营养价值很高且易于消化吸收，是膳食中蛋白质、钙、等微量元素和维生素的的重要来源之一。生乳是乳制品生产的基础，而生乳在生产和运输环节面临着各种人为或非人为安全险因素的干扰。乳制品质量安全事件不断发生，如“三聚氰胺毒奶粉事件”、β-内酰胺酶“无抗奶”、“丙二醇牛奶事件”等造成了及其恶劣的影响。这就使得对生牛乳中污染物、残留物等的分析检测手段至关重要。因此在企业的乳品生产过程中，建立检测方法简便、检测速度快、结果可靠、成本低廉的检测手段以提高其安全性对保证产品质量安全而言至关重要。

胶体金免疫层析技术（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）是基于抗原抗体特异性结合，借助胶体金进行信号放大，实现可视化检测的一种快速固相膜免疫分析技术。操作简单、灵敏度高、方便携带、检测范围广，适合政府监管检验人员用于大批量的食品检测和广泛普查，同时也适用于食品机构或企业的现场快速检测。

2.胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术的原理是氯金酸（HAuCl4）在还原剂柠檬酸三钠作用下，被还原成为一定大小的胶体金颗粒，金颗粒通过在水中的静电排斥力而达到稳定的胶体状态。胶体金在特定环境下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团通过静电吸附作用牢固稳定的结合，由于这种结合是静电结合，所以可以使抗体这类蛋白质依然保持生物特性。胶体金颗粒电子密度高，当粒子聚集超过某一密度阈值时，胶体金就会变色为红色，可以用肉眼观察到。

3.生乳中的安全风险及胶体金免疫层析技术的应用

生乳是指从符合国家有关要求的健康奶畜乳房中挤出的无任何成分改变的常乳。产犊后七天的初乳、使用抗生素期间和休药期间的乳汁以及变质乳不应作为生乳用于出售或一切食品生产活动。生乳中的化学危害物包括真菌毒素、微生物、重金属、兽药农药残留、添加剂等。生乳检测环节强调操作简单，检测时间短，检测结果准确，胶体金免疫层析技术完全符合这些检测要求，现阶段胶体金免疫层析技术对于生乳的检测研究多集中于寻求更加准确的检测结果，更简单的样品处理方式，更短的检测时间以及建立可同时检测多种化学物质的试纸条。

3.1 真菌毒素

真菌毒素是产毒真菌产生的次级代谢产物，是一类对动植物有毒有害并可广泛污染农副产品及乳制品的物质。生乳中残留的真菌毒素主要包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等化学危害物不同种类的镰刀菌毒素。其中，毒性最高的黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1在牛乳中的羟基代谢物，其主要来源是被污染动物饲料，也是乳制品中污染率最高的真菌毒素，严重影响乳制品的食品安全质量，对人体具有强致癌、致畸、致突变性，可对人体造成一系列不可逆转的危害。

我国GB/T2761-2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中要求规定牛乳中黄曲霉毒素M1含量不得超过0.5μg/kg。胶体金免疫层析技术作为检测生乳中残留的AFM1的方法已经有较为成熟的研究。李婕等通过将胶体金免疫层析法与ELISA检测试剂盒法对比检测发现两者的检测结果能够相互对应，检测结果准确性高，通过设置不同浓度梯度的黄曲霉毒素M1验证也发现结果存在一定的梯度效应，且在浓度为0.2μg/kg时开始呈现阳性，远低于国家标准，具有较好的定性初筛价值。吴文晔等应用胶体金免疫层析技术制备了能同时检测黄曲霉毒素B和赭曲霉毒素A两种真菌毒素的胶体金快速检测卡，两者之间没有干扰性，灵敏度均可达到2.5μg/L，重复性、稳定性均良好。

3.2 农药残留

农药具有防止农作物受到病虫害，提高农作物产量的作用，农药可长期存在于环境中，并会在动物和人类体内积累，形成安全风险，因此，农药残留、富集是农业生产中不可避免的。生乳中的农药残留主要与牛食用被污染的饲料有关，即食物链与生物富集效应残留。农药的种类包括有机磷、氯类、氨基甲酸酯类、拟除虫聚酯类等。胶体金免疫层析技术在食品检测领域的应用较为广泛，特别是在农药残留快速检测技术中的运用，已成为提高食品安全检测效率和准确性的重要手段。李洋洋等通过制备有机磷农药的通用结构人工抗原，解决了有机磷农药小分子抗体制备的难题，最终通过优化制作出特异性及准确性良好的试纸条，反应时间在5-10min，样本检测限为200ng/mL。

3.3 兽药残留

兽药的种类主要包括抗菌素类、抗寄生虫类、激素类药物，前两类药物多以抗生素为主主要针对动物的病症及预防，后者则为了提高动物繁殖和生产性能，长期食用含有动物激素残留的食物，会导致人体内的激素水平失衡，尤其对正在发育中的孩子来说容易造成肥胖和性早熟等问题，更有可能引发癌症。在产奶牲畜用药后一段时间内，生鲜乳中会出现抗生素及其代谢物的残留，如果在药物使用后没有一段足够的休药期或滥用、违规使用兽药，其产出的生鲜乳中就会存在抗生素残留。抗生素残留的危害性主要表现在以下方面：长期食用可能会出现超敏反应，短时间内甚至会导致呼吸困难等症状，严重者甚至休克；人体长期服用会造成或增强耐药性，导致药物的有效性降低。

生乳中抗生素检测是最为重要，也是最容易出现安全风险的项目，检测项目主要包括氨基糖苷类、β-内酰胺类、霉素类、四环素类、喹诺酮类等，利用胶体金免疫试纸条对生乳中的抗生素进行检测已成为主要检测手段。袁晓春建立了一种可同时检测生乳、纯牛奶和奶粉中β-内酰胺类-四环素类-头孢氨苄抗生素残留的多重胶体金免疫层析法，且无需对样品进行前处理，可在8min内快速定性生乳中20种抗生素残留。武晋孝等建立可同时检测牛奶中6种氨基糖苷类药物残留的胶体金免疫层析技术，同样无需对样品进行前处理，可在10min内同时检出，经过高效液相色谱对比后结果一致。白宇等针对乳制品中易滥用易残留的激素类药物雌二醇（E2）应用胶体金免疫层析技术建立快速、敏感、准确的测试试纸条，奶样品经2倍稀释消除基质干扰直接用于检测。

3.4 重金属

生鲜乳中的重金属残留主要跟牧场的地址（与市区、工业区的距离）、土壤、饲养方式有关，主要来源于饲料、饮水以及奶畜服用中草药而引起。其中重金属残留主要有铅、汞、镉、铬、砷等。生鲜乳中的重金属残留重金属会在人体中不断积累，且难以降解和排除体外，长期饮用含有重金属残留的乳品，会毒害人体各个脏器、骨髓和免疫系统。

现有研究能通过胶体金免疫层析技术检测对粮食样本中重金属镉、铬离子进行快速检测且能达到较好的灵敏度，而胶体金免疫层析技术对于检测生鲜乳中的重金属物质检测鲜有研究。赵小旭等通过竞争抑制胶体金免疫层析对乳制品中的铅进行检测，生鲜乳的检出限为 25μg/kg，检测结果与仪器法检测结果一致，且重复性好。

3.5 致病菌

生鲜乳中营养物质丰富、水分含量高，很容易导致微生物污染，可携带多种致病菌，包括金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、黄曲霉菌等数十种致病菌，其中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是生鲜乳检测中最常见的两项微生物指标。除此之外，这些致病菌还会携带的耐药因子，导致细菌产生耐药性，其代谢产物中含有的毒素同样也会对人体造成危害引发食源性疾病。而导致生乳微生物污染和超标的主要因素包括：产乳的奶牛患有乳腺炎等疾病从而在挤奶的环节出现污染；饲养环境或挤奶过程不符合卫生标准；生乳储存及运输环节没有保证干净的低温环境。

生乳中致病菌的快速检测方法研究多以ATP生物荧光快速检测技术、电阻抗法、流式细胞计数法等为主，而胶体金免疫层析技术的研究较少，主要问题在于检测灵敏度和微生物抗原的选择较为困难。刘洪贵等采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，用胶体金标记鼠抗金黄色葡萄球菌凝集因子A（ClfA）重组蛋白特异性抗体，该方法可以在10min内完成对含金黄色葡萄球菌奶样的检测，敏感度为1×104cfu/mL以上，稳定性、特异性较好。大肠埃希氏菌O157： H7主要污染的牛肉、牛奶及其制品，王晓芳等采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金溶液标记大肠杆菌O157：H7抗体（6C1E5），研制出的检测试纸检测灵敏度达104CFU/mL，并其他8种菌株无交叉反应，显示出较强的特异性。胶体金免疫层析技术还应用于布鲁氏菌、沙门氏杆菌等其他通常感染生鲜乳的致病菌中，但对于国标规定生乳中不能检出的微生物胶体金免疫层析技术目前只能做到定性初筛。

3.6 添加剂

向生鲜乳中加入添加剂的目的主要是为了造成生乳品质高或掩盖其含有某些违规物质或微生物超标。而添加的物类有熟乳、食盐、蔗糖这类仅为了提高生乳品质而对人体健康危害性不大的物质，也包括三聚氰胺、碱类物质、β-内酰胺酶等危害大的物质。添加三聚氰胺会增加生鲜乳的总氮含量， 从而提高检测时生鲜乳的蛋白质含量以用来通过检测。而β-内酰胺酶可以分解奶牛因使用β-内酰胺类还未过休药期取奶而残留在生鲜乳中的抗生素，造成不存在抗生素残留的假象。碱类物质的加入可以降低生鲜乳因酸败而导致的酸度超标，从而掩盖其已经变质的问题。这些添加剂的加入不仅是欺骗消费的行为，更重要的是会对人体造成不同程度的急性或慢性永久损伤。生乳及乳制品中非法添加三聚氰胺一直都是检测中重点关注的对象，对于三聚氰胺的检测方法已经能实现定性和定量检测，实现样品前处理简单方便，可用于大量样品的筛选。张立静采用双抗夹心法建立了TEM1型β-内酰胺酶的胶体金免疫层析方法，最小检出限为6U/mL，该试纸条灵敏度、特异性、稳定性均良好。

4.展望

生鲜乳从产出到运输再到检测整个过程都需要安全、快速地进行，尤其是检测环节至关重要。生乳检测环节通常要求快速、准确，检测项目多且范围广，因此乳品行业急需能应对各种目标物的快速检测方法。胶体金免疫层析前处理简单、快速、简便等优点，将成为快速检测方法中新型有效的一种初筛手段，能够从乳制品源头、生产到流通各个环节实现安全检测，对于乳品加工企业来讲能够提高产品安全性、节省人力物力，具有重要的经济价值。对于市场监管部门来讲能够准确迅速的对市场上的产品进行筛查，具有重要的社会价值。而目前对于生乳的检测来说，抗生素、真菌毒素及部分添加剂的检测已经能实现全面使用胶体免疫层析试纸条，但微生物检测和重金属检测仍需要利用平板法和大型仪器，这就使得检测时间大大延长，检测所需的仪器和耗材成本也难以降低，这为乳品质量安全和乳品企业的长期发展带来隐患和难题。

因此，快速检测技术的迅速发展和胶体金免疫层析检测项目全面覆盖，是乳品行业乃至整个食品行业亟需解决的问题。同时胶体金免疫层析技术的功能完善，实现更加准确的半定量、定量检测，也将成为食品安全快速检测的发展新趋势。

第一作者

王琴（1981.03-），女，汉族，新疆克拉玛依人，硕士，副高级畜牧师；研究方向：液态奶质量管理和产品开发。

*通讯作者

任远庆（1980.06-），男，汉族，新疆克拉玛依人，硕士，畜牧师。