与番茄灰叶斑病抗病基因Sm连锁的CAPS标记开发

摘    要：利用与番茄灰叶斑病Sm基因连锁的RFLP标记，设计开发了一个CAPS标记，用于抗番茄灰叶斑病育种。以已知抗病基因型的番茄种质为材料，参照与Sm基因紧密连锁的RFLP标记设计特异引物，进行PCR扩增，产物克隆测序分析寻找特异性酶切位点，开发了一个与抗病基因Sm紧密连锁的CAPS标记，命名为T280。利用特异引物T280进行PCR扩增，供试材料均扩增出1条655 bp的特异条带。经限制性内切酶Mme I酶切后，抗病纯合材料仍保留1条655 bp的特异条带，感病纯合材料产生206 bp和449 bp的特异条带，抗病杂合材料产生206 bp、449 bp和655 bp的特异条带。利用不同遗传背景的番茄材料对该标记进行验证，结果发现，能够区分抗病杂合、抗病纯合和感病纯合材料。开发的CAPS标记稳定可靠，是一个比较理想的共显性CAPS标记，可用于Sm基因的分子标记辅助育种。

关键词：番茄；灰叶斑病；Sm基因；分子标记辅助育种

中图分类号：S641.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）04-047-09

Development of CAPS markers closely linked with Sm gene of tomato resistant to gray leaf spot

HAO Yaogang， SONG Jianjun， LI Ke， LI Zhenxia

（College of Food and Biology， Heibei University of Science and Technology， Shijiazhuang 050018， Hebei， China）

Abstract： Taking advantage of the RFLP marker closely linked to the resistant gene Sm to tomato gray leaf spot， we designed and developed CAPS marker to tomato gray leaf spot disease breeding. Using the known genotype tomato germplasm resources as materials， designed the specific primers according to the RFLP markers closely linked to gene Sm， the experiment conducted PCR amplification， the product was cloned and sequenced to search for specific restriction sites. A CAPS marker named T280 closely linked to the resistant gene Sm was successfully developed. Using T280 specific primer to PCR amplification， all materials amplified a specific band with length of 655 bp. After digested by restriction endonuclease Mme I， homozygous resistant material still contained a specific band with length of 655 bp， homozygous susceptible material produced two specific bands with lengths of 206 bp and 449 bp， and heterozygous resistant materials produced three specific bands with lengths of 206 bp， 449 bp and 655 bp. Verified T280 marker through the different genetic background tomato materials， the study showed T280 marker was stable and reliable， could succesfully distinguish heterozygous resistant materials， homozygous resistant materials and homozygous susceptible materials， and a relatively idea co-dominant marker. Therefor， it can be used in gene Sm marker assisting breeding.

Key words： Tomato; Gray leaf spot disease; Sm gene; Molecular marker assisted breeding

番茄灰叶斑病是由番茄葡柄霉（Stemphylium lycopersici）[1-6]或茄葡柄霉（Stemphylium solani）[1]侵染叶片所致的病害，是番茄生产上常见的病害，多发生于空气湿度大、温度较高的春夏季，具有发病范围广、传播速度快等特点。一旦发现染病个体，便会大面积暴发，难以及时防治，造成20%～80%的减产，导致番茄产量和品质严重下降[7]。防治番茄灰叶斑病最根本最有效的方法是选育抗病品种。

传统的番茄育种依赖于表型性状选择，环境条件对表型的影响极大地限制了选择效率，而且田间筛选是一个复杂耗时的过程，需要特定的生长条件[8-9]。相较于常规育种技术，通过分子标记辅助选育不受时间、地域因素的限制，选择过程迅速准确，与目标基因紧密连锁的分子标记的开发已成为实现高效辅助选择育种的重要前提[10-11]。番茄对灰叶斑病的抗性主要是由野生醋栗番茄中的Sm基因决定的[12-13]，目前Sm基因是仅有的已知番茄灰叶斑病抗病基因。关于抗病基因Sm及其分子标记的研究已有一些文献报道，JI等[14]利用RFLP标记CT55，经限制性内切酶酶切，开发了一个隐性的CAPS标记；高建昌等[15]于2017年建立了与抗性基因Sm连锁的InDel标记；2018年Su等[16]利用抗病品种9706和感病品种Heinz 1706杂交产生F2群体对Sm基因进行了精细定位，该基因被定位到11号染色体标记InDel343和InDel-FT-32之间，随后，又开发出共显性标记Sm-InDel。高存等[13]建立了一个与抗性基因Sm连锁的共显性CAPS标记T050。金凤媚等[17]利用HPM方法开发出无需酶切的分子标记。杨欢欢等[18]于2020年创建了一个新的与Sm抗病基因连锁的分子标记。迄今为止，开发的番茄灰叶斑病Sm抗性基因的分子标记，大都存在着抗、感条带片段大小相近，不易分辨，与田间抗性的吻合率较低等问题（表1），在辅助选择育种中的应用受到极大限制。因此，新的、实用性强的抗病基因分子标记开发已成为番茄辅助育种亟待解决的问题[19-21]。

酶切扩增多态性序列（cleaved amplified polymorphism sequences，CAPS）标记是一种依赖于酶切位点的共显性标记，是当前番茄辅助选择育种中应用最广泛的标记之一[22]。笔者以抗病（Sm/Sm）、感病（sm/sm）和杂合（Sm/sm）基因型番茄材料为试材，根据抗病基因Sm两侧的RFLP标记序列设计特异引物进行PCR扩增，扩增片段测序并分析寻找酶切位点，以期建立一个新的、能够区分抗病纯合、感病纯合和抗病杂合材料的共显性CAPS标记，并将建立的分子标记初步应用于番茄灰叶斑病抗病种质材料的鉴定与筛选中，为今后番茄抗病育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

分子标记建立所用材料分别是抗病纯合体T18（Sm/Sm）、感病纯合体T14（sm/sm）和抗病杂合体T31和T35（Sm/sm）。用12种不同遗传背景的番茄种质，对分子标记的有效性和可靠性进行验证。所用材料如表2所示。

利用建立的CAPS标记，对98种不同来源、不同背景的番茄育种材料进行抗病基因型鉴定和筛选，所用番茄种质材料见表3。所有供试材料在2021年种植于河北省石家庄市笔者所在课题组的实验基地。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计 Sm基因是目前发现的番茄灰叶斑病唯一抗病基因，位于11号染色体RFLP标记C2_At1g44790和C2_At4g10050之间[12，23]（图1）。笔者参照与Sm基因紧密连锁的C2_At1g44790、C2_At1g44446、C2_At4g08280、C2_At5g13410和C2_At5g13390等5个RFLP标记设计特异性引物[13，18，24]，引物序列见表4。

1.2.2 基因组DNA提取及PCR扩增 将试验材料播种至72孔育苗盘中，待幼苗长至2～3片真叶时，每个品种选取10株，取幼嫩叶片采用植物基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技有限公司（北京）]提取DNA，每个样品3次重复。用上述5对引物进行PCR扩增，25.0 μL反应体系。其中2×PCR BsteaqTMMasterMix 12.5 μL、模板DNA 0.5 μL、上下游引物各0.5 μL，用无菌水补足反应体系。

PCR扩增程序见表5，循环30次，扩增产物4 ℃保存。

1.2.3 TA克隆及酶切位点分析 选用pTOPO-Blunt Simple试剂盒[天根生化科技有限公司（北京）]，采用许艺珊等[25]、殷宪伦等[26]的方法克隆PCR产物，分别挑取T18、T31、T35和T14材料单菌落送测序，使用DNAMAN软件比对测序结果，采用SnapGene软件查找特异酶切位点。

1.2.4 酶切反应 酶切体系（40 μL）：Mme I酶（NEB公司）1 μL，PCR产物13 μL，缓冲液4 μL，ddH2O补足。37 ℃酶切2 h。

1.2.5 凝胶电泳 用2.0%琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物和酶切产物，120 V电泳100 min，凝胶成像仪观察保存结果。

1.3 数据分析

根据测序结果确定PCR扩增产物片段大小，使用序列比对软件DNAMAN和分析软件SnapGene，对PCR扩增产物测序结果进行序列比对及特异性酶切位点分析，根据酶切位点确定酶切片段大小。每次试验3次重复。

2 结果与分析

2.1 分子标记建立

2.1.1 PCR扩增结果 以提取的基因组DNA为模板，用5对特异引物分别扩增供试材料，引物T280扩增结果如图2所示。研究发现，抗病纯合体T18（Sm/Sm）、感病纯合体T14（sm/sm）、抗病杂合体T31和T35（Sm/sm）均扩增出一条655 bp的特异条带。其他引物虽有目的条带扩增，但经DNAMAN和SnapGene分析后并未发现有效的酶切位点。

2.1.2 酶切位点分析 将引物T280扩增片段克隆测序，序列经DNAMAN进行比对分析，结果如图3所示。抗病和感病材料均扩增出1条655 bp的特异条带，抗病纯合材料T18和感病纯合材料T14在第242和第531位上存在SNP差异。杂合基因型材料T31和T35的扩增片段一条链序列同T18，另一条链序列同T14。通过软件SnapGene分析，发现感病材料T14扩增序列具有一个限制性内切酶Mme I的识别和作用位点TCCRAC，且切割位点位于第206位碱基处，而抗病纯合材料T18扩增序列不存在Mme I酶切位点。因此，通过限制性核酸内切酶Mme I酶切，筛选到一个能成功区分所有供试种质材料基因型的共显性CAPS标记。

2.1.3 酶切结果 引物T280扩增产物经Mme I酶切后，不同材料呈现酶切多态性。抗病纯合材料T18无酶切位点，仍为1条长度655 bp的条带；感病纯合材料T14产生了2条带，长度为206 bp和449 bp；抗病杂合材料T31和T35均产生3条带，长度为206、449和655 bp（图4）。酶切结果符合预期，标记T280为共显性CAPS标记，能够准确区分所有供试种质材料的基因型。

2.2 分子标记的验证

选用12种不同背景的种质资源验证T280标记的可靠性和有效性。结果如图5所示，12种材料，无论抗病纯合材料、感病纯合材料还是抗病杂合材料，PCR扩增均得到1条特异条带，长度为655 bp（图5-A）。扩增产物经Mme I酶切后，5种抗病纯合材料T11、T12、T28、T72和T73产生1条长度为655 bp的特异条带；3种感病纯合材料T45、T70和T71产生2条特异条带，长度为206、449 bp；4种抗病杂合材料T03、T33、T68和T69产生3条特异条带，长度为206、449、655 bp（图5-B）。结果表明，酶切片段多态性可正确对应供试种质基因型，标记T280在其他番茄育种材料中表现稳定可靠、有效性高，可用于分子标记辅助育种。