大白菜Ogura胞质雄性不育恢复材料的创制与检测

摘    要：针对白菜类蔬菜（Brassica rapa L.）中缺乏Ogura胞质雄性不育育性恢复材料的问题，利用远缘杂交技术将恢复基因Rfo从甘蓝型油菜导入大白菜中，利用种间杂交种不断与不育系进行回交，已分别获得BC1、BC2和BC3代育性恢复材料。同时，利用形态学、细胞遗传学、分子生物学手段对所创制的材料进行检测，利用恢复基因Rfo特异性引物扩增，最后筛选获得了一株育性稳定、形态特征接近大白菜、染色体数目为20的BC3单株。利用所创制BC3单株进行Ogura雄性不育大白菜商品杂交种恢复测试，结合表型及恢复基因Rfo、不育基因orf138特异性引物检测，结果表明，所创制恢复系恢复基因有效。

关键词：大白菜；Ogura胞质不育；恢复基因；材料创制

中图分类号：S634.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）04-037-10

Development and detection of fertility-restored BC3 progenies in Ogura CMS Chinese cabbage

WEI Xiaochun， YUAN Yuxiang， ZHAO Yanyan， YANG Shuangjuan， SU Henan， WANG Zhiyong， WANG Xiaoqing， RAN Ran， LI Lin， NIU Liujing， ZHANG Xiaowei

（Institute of Horticulture， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： Aiming at the lack of restorer of-fertility germplasm resources in Ogura cytoplasmic male sterility（Ogura CMS）Brassica rapa， the Rfo（restorer of fertility）gene was introduced from Brassica napus to Chinese cabbage by distal hybridization， and BC1， BC2 and BC3 generation fertility recovery materials were obtained respectively. Through morphology， cytogenetic and molecular biological methods， meanwhile， combined with the PCR products with Rfo-specific primers， a single BC3 plant with stable fertility， similar morphological characteristics， with 20 chromosomes was obtained. The recovery test of commercial Ogura CMS hybrid Chinese cabbage was carried out using the BC3 Rfo gene created plant， combined with phenotype checking， Rfo and orf138 specific primer detection， which showed that the restorer of fertility gene of the created line was effective.

Key words： Chinese cabbage; Ogura CMS; Rfo gene; Germplasm resources creation

国家历来重视农业生产，自2004年以来，中央“一号文件”把种业发展提升到国家战略高度。近年来，我国种业发展势头良好，取得了一些突破，水稻、玉米、小麦等三大主粮高效育种技术体系逐渐完善，主要农作物自主选育品种占比在95%以上，基本实现主要粮食作物良种全覆盖。但很多种子的进口量远大于出口量[1]，抗根肿病耐抽薹十字花科蔬菜品种就是其中一个例子，而且大都是雄性不育系制种，利用雄性不育系材料进行种质创新，最有效的办法就是筛选对应合适的恢复系。然而，在大白菜类蔬菜中尚未发现Ogura雄性不育恢复基因材料。

Ogura雄性不育系是日本科学家Ogura首次在萝卜中发现的天然雄性不育类型，雄性败育彻底，为迄今发现的芸薹属作物不育源中不育性最理想的类型[2]，越来越多的Ogura雄性不育系被用于生产白菜类蔬菜杂交种，杂交种纯度可达到100%。但由于Ogura是一种典型的母系遗传性状，降低了种质资源的多样性，如日本大白菜AKIMEKI是一个抗根肿病的品种，含有3个抗性基因，但由于其为Ogura胞质雄性不育系杂交种，不能直接用于种质资源创新。降低Ogura胞质带来的潜在风险，加强种质资源的创新利用，可以通过实现胞质多样化来开发新的胞质资源，如CMS-Pol、CMS-Nap、CMS-Hau、CMS-orf 220[3]，也可以创制Ogura胞质不育恢复系，恢复不育材料的育性。国内外现已有甘蓝类蔬菜Ogura恢复系创制的报道[4-5]。主要是通过芥蓝（CC基因组）与携带恢复基因（Rfo）的油菜（AACC基因组）远缘杂交后，利用胚挽救技术获得种间杂种F1，利用恢复基因标记检测，以不育系为母本、恢复基因阳性单株为父本，进行连续回交后得到BC3代，获得染色体数为18、遗传背景接近于芥蓝Ogura CMS的恢复材料[5]。

远缘杂交在创制新的作物类型、利用外来属种的特殊有利性状丰富作物变异类型、创制新的雄性不育源、探索和研究生物进化等方面具有重要意义。在十字花科作物中，为了克服远缘杂交中幼胚死亡或败育，研究人员利用胚胎挽救技术获得了结球甘蓝×大白菜、萝卜×大白菜、大白菜×萝卜等远缘杂交种[6-7]。为了促进两属作物间的优良基因交换，Bannerot等[8]利用Ogura萝卜不育胞质材料转育成甘蓝、甘蓝型油菜不育系。方智远等[9]利用胚挽救技术将萝卜雄性不育系转移至结球甘蓝。程雨贵等[10]对萝卜和甘蓝正反杂交后的杂种胚进行胚挽救，结果表明，以萝卜作为母本较容易成功，而以甘蓝为母本则很难成功。利用远缘杂交技术进行恢复基因转移，首先要知道恢复基因所在的染色体位置。萝卜中Ogura胞质不育恢复基因所在的位置为R9染色体[11]。将恢复基因导入到甘蓝型油菜后，通过原位杂交等技术将Rfo基因定位到甘蓝型油菜C9染色体上[12]。恢复基因的成功定位及克隆[11，13]也为定向转移恢复基因及分子标记开发提供了背景及序列基础。

迄今尚未发现白菜类作物中存在Ogura雄性不育系的恢复系，因此迫切需要创制白菜类作物Ogura细胞质雄性不育的恢复材料。由于油菜与萝卜中恢复基因分别在C9及R9染色体上，相对于甘蓝类蔬菜（CC基因组）恢复系材料的创制，白菜类蔬菜（AA基因组）会更加困难。通过远缘杂交将甘蓝型油菜育性恢复基因Rfo导入到大白菜中，然后将种间杂种进行连续回交，获得回交BC1、BC2和BC3代育性恢复材料。然而，这些回交材料的遗传背景与大白菜仍存在一定差异，还需进一步回交。在保留恢复基因Rfo的同时，需尽可能消除甘蓝型油菜的遗传背景，这对最终实现Ogura CMS白菜类蔬菜的育性恢复具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 雄性不育系恢复系材料选择

Ogura雄性不育系大白菜Tyms（Brassica rapa ssp. pekinensis，AA基因组）由河南省农业科学院园艺研究所叶类蔬菜课题组提供；含恢复基因的甘蓝型油菜P1755（Brassica napus L.，AACC基因组），由河南省农业科学院经济作物研究所张书芬研究员馈赠。

Ogura CMS大白菜杂交商品种AKIMEKI（Brassica rapa ssp. pekinensis，AA基因组），购自日本农林社株式会社（Norin）。

以大白菜Tyms为母本、甘蓝型油菜P1755为父本，制备种间杂交组合。蕾期进行套袋、人工授粉。杂交前2～3 d，摘除父本花序上已经开放的花朵，套袋隔离。套袋父本开花当天取花药，与母本植株适宜大小的花蕾进行剥蕾授粉。授粉后，套袋进行隔离，以防外来花粉污染。

杂交F1：Tyms×P1755。

第1代回交：母本为Ogura雄性不育系大白菜Tyms，父本为种间杂交F1代育性恢复Rfo单株（AAC+基因组）。

第2代回交：母本为Ogura雄性不育系大白菜Tyms，父本为BC1代回交后通过标记筛选获得的具有良好育性的恢复单株（AA+基因组）。

第3代回交：母本为Ogura雄性不育系大白菜Tyms，父本为BC2代回交后通过标记筛选获得的具有良好育性恢复、遗传背景更接近大白菜母本的优良单株（AA基因组）。

上述材料均由河南省农业科学院园艺研究所叶类蔬菜课题组提供，均定植于河南现代农业研究开发基地，常规栽培管理，2018年春季开始，2021年获得BC3、BC4株系。

1.2 染色体观察

试验前期在试验田分别选取Ogura CMS不育系（Tyms）大白菜母本、恢复系（P1755）油菜父本及F1、BC1、BC2、BC3代中育性不同的植株，分别标号，并取其花蕾，分别用卡诺氏液固定保存，定期更换卡诺氏液。

之后在纯水中选择固定好的适当大小的花蕾，2倍显微镜下解剖，取出一粒完整花药放入1 mol·L-1盐酸中，并在60 ℃烤片机上预热2 min。酸解完成后，取出花药，机械敲碎，用改良的苯酚品红染液染色，并在40倍镜下筛选处于减数分裂时期的花药，分别标记保存。将已筛选出的花蕾进行酶解、低渗与荧光染色制片等一系列操作，并对育性不同的各世代植株进行染色体细胞学分析，荧光显微镜（型号：LEICA CTR4000）观察（花粉粒染色体各个时期配对情况），观察并记录染色体数，比较染色体形态与分裂是否异常，计算恢复基因的传递效率[14]。

1.3 植物细胞学倍性鉴定及细胞分裂过程观察

流式细胞仪用于鉴定远缘杂交杂种后代的倍性，取杂种后代植株叶片，利用流式细胞仪（CyFlow Cube 8）（德国PARTEC公司）检测植株倍性。在本试验中，以大白菜（Tyms）、甘蓝（CC）、甘蓝型油菜（P1755）为模板，将电压调节至523 V，根据图中峰值位置判断植株倍性[15]。利用大白菜Ogura雄性不育系Tyms为母本、含有恢复基因的油菜P1755为父本进行远缘杂交，获得种间杂交种，观察各个时期染色体减数分裂的变化，即细线期、粗线期、终变期、减Ⅰ中期、减Ⅰ后期、减Ⅱ中期、减Ⅱ后期[16]。

1.4 引物开发及恢复基因的PCR检测

以萝卜Ogura胞质不育恢复基因Rfo序列信息（NCBI登录号：AJ550021.1）为目标序列，在大白菜与油菜基因组数据库（http：//www.brassicadb.cn/#/Download/）进行Blast比对。萝卜Ogura细胞质雄性不育恢复基因Rfo位于R09染色体上，甘蓝型油菜A09染色体、C09染色体以及大白菜A09染色体上存在Rfo同源序列。根据Rfo基因与亲本的序列比对结果，设计开发出2对引物，即RsRfo-F/RsRfo-R及Rfo-105F/Rfo-545R。