黄瓜bZIP基因家族鉴定及功能分析

摘    要：为研究bZIP家族基因在黄瓜表皮毛发育过程中的功能，利用生物信息学方法对黄瓜bZIP家族基因进行全基因组鉴定、染色体定位、系统进化分析、基序分析和结构域预测，并结合转录组分析和拟南芥异源转化，筛选与黄瓜表皮毛发育相关的基因。结果表明，黄瓜全基因组编码75个bZIP家族成员，不均等地分布在黄瓜的7条染色体上。该家族成员分为10个亚家族，各亚族成员具有相似的基因结构和保守基序。其中，对4个差异表达的bZIP基因CsaV3_7G003290、CsaV3_4G004890、CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530的拟南芥同源基因突变体表型观察发现，Atbzip47和Atbzip56拟南芥突变体茎秆处表皮毛数量显著减少。将CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530基因在Atbzip56突变体中进行异源转化，回补了Atbzip56突变体的表型。此结果为进一步解析CsbZIPs基因成员在黄瓜表皮毛发育中的功能和调控路径提供了参考。

关键词：黄瓜；bZIP基因家族；家族分析；表皮毛发育

中图分类号：S642.2            文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）04-026-011

Identification and preliminary explorating function of cucumber bZIP gene family

FAN Pengfei， ZHAO Lijun， WANG Yueling， XU Nana， HU Ruikun， CHEN Mingyue， ZHANG Mengyao， YANG Luming， YANG Sen

（Horticulture College of Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： The purpose of this study was to understand the roles of bZIP family genes during trichome development in cucumber， The genome-wide identification， chromosomal localization analysis， phylogenetic tree analysis， conserved sequence analysis， motif analysis and structure domain prediction of bZIP family genes were performed using bioinformatics methods， and combined with transcriptome analysis and Arabidopsis heterotransformation to screen genes associated with cucumber trichome development. The results showed that the cucumber genome encodes 75 members of the bZIP family， these members were unevenly distributed on nine chromosomes. These members were divided into 10 subfamilies， and the same subfamily shared the similar genetic structures and conserved motifs. The phenotypic observation of the Arabidopsis homologous gene mutants of four differentially expressed bZIP genes CsaV3_7G003290， CsaV3_4G004890， CsaV3_2G031960 and CsaV3_3G046530， the number of trichome on the stem of Atbzip47 and Atbzip56 Arabidopsis mutants was significantly reduced. Heterologous transformation of CsaV3_2G031960 and CsaV3_3G046530 gene in Atbzip56 mutant complements the phenotype of Atbzip56 mutant. This result provides a reference for further understanding the function and regulation pathway of CsbZIPs gene members in cucumber trichome development.

Key words： Cucumber; bZIP gene family; Family analysis; Trichome development

碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子家族是规模最大、种类最多的家族之一。bZIP转录因子（bZIP-TFs）具有保守的bZIP结构域，由2个结构特征组成：特异结合DNA的基本区域和亮氨酸拉链二聚基序的基本区域[1]。除了bZIP结构域外，bZIP转录因子还有其他一些结构域，如富含谷氨酰胺的基序和磷酸化位点[R/KxxS/T][2]。为了与DNA结合，基本区域的N端一半与双链DNA的主槽结合，而Leu拉链的C端一半通过二聚作用形成重叠的卷曲结构。目前，bZIP家族成员已在植物、动物和酵母等多种真核生物基因组中得到鉴定或预测。据报道，bZIP转录因子参与了胁迫生长条件下的发育和生理过程，被认为是应对各种非生物胁迫的重要调节因子，如拟南芥[3]、水稻[4]、小麦[5]、番茄[6]、辣椒[7]、大豆[8]和玉米[9]中的干旱、高盐和低温胁迫。此外，bZIP转录因子在响应信号通路也发挥着重要作用，包括ABA信号、光信号、渗透和病原体感染[10]。因此，它们对各种植物抵御不利的环境条件非常重要[1]。在植物中，bZIP蛋白除了响应各种生物/非生物胁迫外，还在生长和发育中发挥重要作用[11]。在发育过程中，bZIP-TFs在器官和组织分化、细胞伸长、氮/碳和能量代谢、未折叠蛋白应答、种子贮藏蛋白基因调控体细胞胚胎发生等方面起着关键作用[12-17]。

黄瓜（Cucumis sativus L.）是葫芦科甜瓜属一年生草本植物，在全世界范围内广泛种植，同时也是我国设施栽培的主要蔬菜种类之一。华北型黄瓜、华南型黄瓜和欧洲温室型黄瓜是我国市面上常见的几类黄瓜品种。相对于光滑无刺的欧洲温室黄瓜果实，华北型和华南型黄瓜果实表面密集着生大量果刺。“顶花带刺”是中国消费者挑选华北型黄瓜的一大标准，因此，果刺密度及大小逐渐成为黄瓜果实重要的外观品质性状，已经成为改善黄瓜果实商品品质的主要目标[18-19]。就黄瓜果刺形成而言，其发育过程可分为果刺的起始、基座膨大、成熟和衰老等4个阶段，其中，每个阶段都可能会涉及不同的基因参与调控[20]。目前为止，已被报道的调控黄瓜果刺发育的基因涉及HD-ZIP家族、MYB家族、C2H2锌指蛋白、WD-repeat蛋白以及bHLH家族基因等不同基因家族的成员[21-23]。植物激素也被报道调节黄瓜果刺性状起始和分化阶段，包括赤霉素、细胞分裂素、生长素和乙烯途径都参与了黄瓜果刺的发育[21]。黄瓜果刺性状已然挖掘到许多相关基因和激素通路，但光照、温度以及水肥等外界因素对果刺的影响仍然不清楚。bZIP转录因子在生物/非生物胁迫以及响应信号通路中发挥着重要作用，但黄瓜bZIP家族基因的研究还较少，有关其功能还不清楚。笔者通过全基因组分析鉴定出黄瓜bZIP家族基因，结合果刺突变体材料的转录组测序数据分析和异源转化回补拟南芥突变体表型观察，表明黄瓜bZIP基因家族中CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530基因在黄瓜表皮毛发育过程中可能具有调控作用，研究结果可为后续开展CsbZIPs对黄瓜表皮毛调控的分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和处理方法

黄瓜大果刺基座L-SB及近等基因系小果刺基座S-SB材料均由河南农业大学瓜类分子育种实验室提供。拟南芥突变体从突变体库（http：//www.arashare.cn/index/Product/index.html）购买获得。

试验于2022年5－10月在河南农业大学园艺学院分子瓜类育种实验室进行。拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Col及突变体材料，均使用酒精消毒30～60 s后，清水清洗2～3遍，然后使用3% NaClO溶液消毒15 min，期间不停晃动，之后灭菌水清洗3～5遍，播种于MS培养基中。4 ℃冰箱放置3 d后放入组培室（光照16 h，黑暗8 h，恒温25 ℃）中培养，待长至2～4片真叶时挑选根系健壮的幼苗移栽至基质中。光照培养箱中（日温24 ℃，夜温16 ℃，光照16 h，黑暗8 h）正常生长，每隔1周浇水1次[24]。

1.2 黄瓜bZIP基因家族成员鉴定

将拟南芥数据库（http：//www.arabidopsis.org）中已知的20个bZIP基因保守序列，通过TBtools软件Blast搜索获得黄瓜bZIP候选基因。此外，在葫芦科数据库（http：//www.cucurbitgenomics.org/）使用关键词bZIP检索。从PFAM数据库下载bZIP结构域的HMMER文件，从黄瓜基因组中提取具有bZIP结构域的蛋白序列。三者结合，最终确定黄瓜bZIP家族成员。

1.3 系统发育分析

分别从葫芦科数据库和拟南芥数据库下载了bZIP蛋白序列，利用MEGA 7.0构建系统进化树，其中聚类分析使用邻接法Neighbor-Joining，进行Bootstrap测试，重复数为1000，进化距离的计算方法为Poisson model。利用AI工具进行美化。

1.4 保守结构域分析

应用MEME（https：//meme–suite.org/meme/）预测分析bZIP蛋白序列的结构域，搜寻Motif值设置为10，结构域宽度设定为最小10、最大100，其他参数为默认值。再利用TBtools对保守结构域进行筛选和可视化[25]。

1.5 染色体定位

从葫芦科数据库下载黄瓜bZIP基因文件，根据基因组注释文件中提供的位置信息，将所有黄瓜bZIP基因定位到相应的染色体上。利用TBtools软件绘制出染色体分布图[26]。根据bZIP基因在每条染色体上分布个数进行量化统计。

1.6 黄瓜bZIP基因家族qRT-PCR分析

根据黄瓜bZIP基因的CDS序列设计qRT-PCR引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，使用华越洋RNA提取试剂盒提取总RNA，并使用诺维赞反转录试剂盒反转录得到cDNA。使用NCBI中的primer-blast功能设计CsbZIPs的特异性定量引物，按照诺维赞荧光定量PCR试剂盒步骤，以黄瓜cDNA为模板检测CsbZIPs成员的表达量。基因相对表达量按照2-△△Ct方法计算[27]。其中，内参基因为CsACTIN，每个检测的样本都设置了3个生物学重复和3个技术重复，绘图使用GraphPad Prism软件。

1.7 拟南芥遗传转化

过量表达载体的构建：从黄瓜cDNA中克隆得到CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530 CDS序列，将此片段连接到pFGC5941载体酶切位点Asc Ⅰ和Pac Ⅰ之间，构建35S：：CsaV3_2G031960和35S：：CsaV3_3G046530过量表达载体，将载体转化农杆菌感受态GV3101。

拟南芥遗传转化[28]：根据上述拟南芥播种方法播种拟南芥Atbzip56突变体，待拟南芥长出5 cm主茎时剪去主茎，促使拟南芥长出更多的侧枝，等拟南芥长至10～15 cm时剪去所有露白和开放的花以及荚果，按照花序侵染法流程，侵染拟南芥。黑暗18～22 h后正常生长，约30 d后收获T1种子。将T1代种子根据上述拟南芥播种方法播种在质量浓度为20 mg·L-1 Basta的MS培养基上，待长至2～4片真叶时仍然生长健壮的幼苗移栽至基质中，随后进行DNA鉴定，获得的阳性苗可在显微镜下进行表型观察。