枯萎病菌毒素粗提液对美洲南瓜幼苗生长及生理的影响

摘    要：为了揭示美洲南瓜枯萎病菌产生的毒素粗提液对幼苗的影响，研究了病原菌产毒的条件以及不同浓度毒素粗提液对美洲南瓜幼苗生长及生理的影响。结果表明，美洲南瓜枯萎病菌在pH值=7的Czapek培养液中24 h连续光照、振荡培养15 d时，产毒效果最明显，对美洲南瓜种子胚根生长抑制率最高，毒素粗提液亦具有较强的热稳定性。80%的病原菌毒素粗提液，对美洲南瓜株高、茎粗和根长的生长抑制效果最好。处理11 d时，80%毒素粗提液处理下，美洲南瓜幼苗根系和叶片的细胞膜透性分别达到62.71%和62.31%；叶片MDA含量为对照的2.61倍，叶片PAL活性最高，为84.25 U·g-1，是对照处理PAL酶活性的2.09倍。研究结果可为揭示美洲南瓜枯萎病菌的致病机制提供一定的理论依据。

关键词：美洲南瓜；枯萎病菌；毒素；生长；细胞膜透性；生理指标

中图分类号：S642.6 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）04-081-08

Effects of crude toxin extract in the pathogen causing Cucurbita pepo Fusarium wilt on the growth and physiology of seedlings

LIU Jia， CHAI Gaifeng， GUO Fengqing， ZHANG Shuwu， XU Bingliang

（Biocontrol Engineering Laboratory of Crop Diseases and Pests of Gansu Province/College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， Gansu， China ）

Abstract： In order to reveal the effect of crude toxin produced by pathogen causing Cucurbita pepo Fusarium wilt， the toxin-producing conditions of Fusarium oxysporum and the effects of different concentrations of toxin crude extract on the growth and physiology of Cucurbita pepo seedlings were studied．The results showed that：In the Czapek medium of pH=7， 24 hours of continuous light and shaking culture for 15 days， the toxigenic effect was the most obvious， and the growth inhibition rate of the radicle of Cucurbita pepo seeds was the highest．The crude toxin extract has strong thermal stability．80% of the toxin crude extract had the greatest growth inhibitory effect on plant height， stem diameter and root length．Under the treatment of 80% crude toxin extract， the cell membrane permeability of Cucurbita pepo seedlings roots and leaves reached 62.71% and 62.31% on the 11th day of treatment， respectively; The content of MDA in leaves was 2.61 times that of the control， and the activity of PAL in leaves was the highest， which was 84.25 U·g-1， which was 2.09 times that of the control．The research results provided the theoretical basis for revealing the pathogenic mechanism of Cucurbita pepo Fusarium wilt．

Key words： Cucurbita pepo; Fusarium wilt; Toxin; Growth; Cell membrane permeability; Physiological indicators

美洲南瓜（Cucurbita pepo）是葫芦科南瓜属一年生蔓性草本植物，因其营养成分种类多，药用和食用价值极高，在我国很多地区都有种植[1-2]。甘肃省武威市是美洲南瓜重要的育种基地，美洲南瓜也是当地重要的经济作物之一，生产的南瓜籽远销海外[3]。

瓜类枯萎病（Fusarium wilt）是由镰孢菌引起的土传病害，也是瓜类生产中的毁灭性病害[4]。其中，以西瓜发病最为严重，其次是南瓜，一般发病率为20%～30%，严重时达80%[5]，有时在连作地甚至造成全田死亡。因此，瓜类枯萎病是瓜类生产上的一大难题，也是限制美洲南瓜生产的重要因素之一[6]。前人研究表明，引起甘肃省武威市美洲南瓜枯萎病的致病菌为尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）[5]。

镰孢菌引起植物发生枯萎病的生理水平上致病机制，一种是导管阻塞，另一种是致病毒素。镰孢菌产生的毒素-镰刀菌酸损伤宿主植物根系细胞膜，增强细胞的通透性，同时降低线粒体活性氧的含量、阻止ATP合成，从而导致植物根系水分吸收受阻，生长受到抑制[7]。目前发现的镰孢菌可以产生最重要的3类真菌毒素（伏马菌素、单端孢霉烯族毒素和玉米赤霉烯酮），也能够产生包括恩镰孢菌素、串珠镰刀菌素和白僵菌素在内的新型真菌毒素[8]。

同一种镰孢菌在人工培养基和植物体内的产毒种类可能存在差异，同时在人工培养条件下的产毒能力也受到培养基成分、温度、湿度等环境条件的影响[9-10]。如苦瓜枯萎病菌毒素发酵的最佳培养液为Czapek培养液，最佳培养时间为14 d，装液为100 mL。该毒素发酵滤液在高温高压下具有较好的稳定性[11]。

也有研究结果表明，拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米不同品种的发芽率、幼苗生长均有显著影响[12]。孔前前等[13]研究表明，尖孢镰孢菌QD3-2产生的毒素对苜蓿种子萌发和胚根生长均具有抑制作用。庄敬华等[14]研究发现甜瓜枯萎病菌毒素粗提液对甜瓜胚根的生长具有显著的抑制作用，诱发甜瓜幼苗表现典型的枯萎病萎蔫症状，推测该病原菌产生的粗毒素中含有甜瓜生长的抑制性物质。

前人研究发现，尖孢镰孢菌侵入寄主后分泌的毒素物质，改变了寄主植物细胞膜的透性、抑制植物根的生长，而低量毒素又能诱导植物合成植保素[15]。陈慧杰等[16]研究表明，菊花枯萎病菌毒素可抑制切花菊幼苗根、茎的正常生长，增加幼苗根系的细胞膜透性以及根系组织中可溶性糖、脯氨酸和MDA的含量，在短时间内提高根系保护酶POD、PAL和PPO活性。有关美洲南瓜枯萎病菌产生毒素的培养条件以及毒素粗提液对幼苗影响的研究相对较少。

因此，笔者通过探究影响美洲南瓜枯萎病菌产毒的各项培养条件，研究病原菌产生的毒素粗提液对美洲南瓜幼苗生长和生理的影响，以期为探索美洲南瓜枯萎病菌致病机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试药品及试剂盒 马铃薯、葡萄糖、自来水、KNO3、蔗糖、蛋白胨、无菌水、KH2PO4、MgSO4、NaNO3、KCl、FeSO4、琼脂等。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、丙二醛（MDA）含量检测试剂盒均购自上海优选生物科技有限公司。

1.1.2 供试仪器和用具 超净工作台、恒温培养箱、pH计、酶标仪、离心机、灭菌锅、电导仪、电子天平、摇床、烘箱、各种量程的移液器及吸头、各种规格的离心管、研钵、锤形瓶、96孔UV板、圆形玻璃瓶等。

1.1.3 供试病原菌及品种 试验于2020年6月至2021年5月在甘肃农业大学植物保护学院植物病毒与分子生物学实验室进行。植物供试病原菌：美洲南瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum，尖孢镰孢菌），是甘肃农业大学植物保护学院植物病害及生物防治课题组前期从甘肃省武威市金苹果有限责任公司种质资源试验基地患枯萎病的美洲南瓜中分离得到，由甘肃农业大学植物保护学院植物病毒与分子生物学实验室分离鉴定与保存。供试美洲南瓜品种：金苹果2号，由甘肃省武威市金苹果有限责任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的纯化 用接种针从菌种冻存管中挑取美洲南瓜枯萎病菌，在PDA培养基中进行菌种接种，接种5～10皿，转移至25 ℃恒温培养箱中进行纯化培养。

1.2.2 病原菌毒素粗提液的制备 取纯化好的病原菌，用直径为0.7 cm的打孔器打取菌饼，用接种环接入150 mL三角瓶80 mL培养液中，进行灭菌处理，灭菌后在超净工作台上进行操作，每个三角瓶内用接种环接入8个菌饼，试验进行3次重复。将三角瓶放在28 ℃、180 r·min-1的恒温摇床中连续震荡15 d后，将培养液中的菌丝体用纱布过滤掉，接着用6层纱布进行过滤，准备若干50 mL离心管，将毒素滤液收集其中，3000 r·min-1离心30 min，最后弃去沉淀，将上清液装在另一个离心管中，置于沸水浴中水浴10 min，得到毒素粗提液[17]。

1.2.3 培养液对病原菌产毒的影响 设置3种不同培养液：理查（Richard）培养液，硝酸钾5.00 g，硫酸亚铁5 mg、磷酸二氢钾2.50 g、蔗糖2.50 g、硫酸镁0.25 g、蒸馏水500 mL；改良察氏（Czapek）培养液，蔗糖15.00 g、硝酸钠1.00 g、磷酸二氢钾0.50 g、氯化钾0.25 g、硫酸亚铁5 mg、硫酸镁5 mg、蒸馏水500 mL；察氏蛋白胨（PSC）培养液，蔗糖15.00 g、硫酸镁0.25 g、蛋白胨5.00 g、磷酸二氢钾0.50 g、硫酸亚铁5 mg、氯化钾0.25 g、蒸馏水500 mL；以马铃薯葡萄糖（PD）培养液为对照培养液，即葡萄糖10.00 g、马铃薯100 g、蒸馏水500 mL。

将病原菌菌饼接种于上述3种不同培养液和对照培养液（PD培养液）中，振荡培养（25 ℃，15 d），制备毒素粗提液，处理催芽的美洲南瓜种子，人工气候培养箱中培养（28 ℃，48 h），测定美洲南瓜种子胚根生长抑制率，试验进行3次重复。

1.2.4 培养时间对病原菌产毒的影响 在1.2.3筛选出的最佳培养液的基础上（下同），将接有菌饼的培养液于25 ℃震荡培养5、10、15、20、25 d，培养至相应时间时制备毒素粗提液，处理催芽的美洲南瓜种子，在人工气候培养箱中培养（28 ℃，48 h），测定美洲南瓜种子胚根生长抑制率，试验进行3次重复。

1.2.5 培养方式对病原菌产毒的影响 将接有菌饼的培养液置于25 ℃摇床中，设置全天振荡培养、振荡12 h+静置12 h、全天静置3种处理，每组培养15 d，制备毒素粗提液，处理催芽的美洲南瓜种子，在人工气候培养箱中培养（28 ℃，48 h），测定美洲南瓜种子胚根生长抑制率，试验进行3次重复。