甜瓜未授粉子房超低温保存方法初探

摘    要：为延长甜瓜未授粉子房取材时间，克服甜瓜子房取材受生长季节、发育期限制的缺点，以厚皮甜瓜晚熟品种众云18和早熟品种锦绣的子房为试材，对其进行超低温保存和恢复培养研究。结果表明，4 ℃暗处理的甜瓜子房随着预培养和保护液（PVS2）处理时间的增加，子房的存活率呈先增高后降低的趋势，其中，预培养24 h和PVS2处理30 min时效果最佳，子房存活率均在82%以上；子房经过-196 ℃超低温保存后，在38、40、42 ℃卸载液解冻5 min时，子房存活率没有明显差异；超低温保存60 d后的子房，经过恢复培养后，众云18和锦绣子房最高存活率分别达到80.83%、82.43%。采用包埋法和玻璃化法结合的改良超低温保存法可以有效解决甜瓜大孢子培养供体无法持续获得的问题，加速了甜瓜单倍体培育的进程。

关键词：甜瓜；未授粉子房；超低温保存

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）04-076-05

Cryopreservation method of unpollinated ovary in melon

LI Hailun， GAO Ningning， LI Xiaohui， KANG Liyun， CHANG Gaozheng， LIANG Shen， WANG Huiying， XU Xiaoli， ZHAO Weixing

（Horticulture Institute， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to prolong the time of melon unpollinated ovary sampling and overcome the disadvantage that the ovary of melon sampling is limited by the growing season and development period. In this experiment， the ovaries of the late-maturing variety Zhongyun-18 and the early-maturing variety Jinxiu were used as test materials for cryopreservation and recovery culture. The results showed that：With the increase of preculture and protection solution（PVS2）treatment time， the survival rate of melon ovary treated at 4 ℃ in the dark showed increase first and then decrease， and the best results were obtained after 24 h of preculture and 30 min of PVS2 treatment， and the survival rate of ovary was above 82%. After cryoppreservation at -196 ℃， there was no significant difference in the survival rate of ovary when the unloading solution was thawed at 38， 40 ℃ and 42 ℃ for 5 min. After 60 days of cryopreservation， the highest survival rates of Zhongyun-18 and Jinxiu ovaries were 80.83% and 82.43%， respectively. In this study， the improved cryopreservation method combining the embedding method and vitrification method could effectively solve the problem that melon megaspore culture materials cannot be continuously obtained， and accelerate the process of melon haploid cultivation.

Key words： Melon; Unpollinated ovary; Cryopreservation

甜瓜（Cucumis melo L.）是葫芦科甜瓜属一年生草本植物，具有丰富的营养价值和可观的经济价值，在全球范围内广泛种植。甜瓜产业在我国农业产业结构中占据重要地位，具有广阔的前景。目前，甜瓜优异种质资源更新滞后且无法满足市场需求，因此亟需加速育种工作的进度。单倍体培养是创制新种质的重要手段，利用甜瓜未授粉子房或胚珠离体培养获得单倍体，将有效加速甜瓜育种进程，其中，材料是培养成功的先决条件。同时甜瓜离体雌核培养获取单倍体技术还处于初级阶段，并未获得较成熟的技术，加快培养进度需大量的供试材料，而甜瓜未授粉子房的取材受生长季节的限制。为解决材料供应问题，笔者通过在甜瓜生长季节大量取样，并进行超低温保存，增加供材量和延长供样期，从而加速甜瓜单倍体的培育进程。

适宜的保存条件可以使细胞分裂和代谢暂时处于停滞状态从而延长生命周期，还可以最大程度保持材料的遗传稳定性。其中，超低温保存方法是将植物的细胞、组织、器官等离体材料存放于液氮（-196 ℃）中保存[1]，该方法备受青睐，在花粉、茎尖、休眠芽、愈伤组织等离体组织中被广泛应用[2-6]，但对甜瓜子房的保存鲜见报道。笔者的研究结合包埋法和玻璃化法对超低温保存方法进行改良，旨在探索最适合甜瓜子房的保存方法，最大限度减少材料损伤，并保持较高的活性，以期加速甜瓜单倍体育种的进度，为创制新种质提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

供试厚皮甜瓜品种为晚熟品种众云18（网纹红肉）和早熟品种锦绣（白皮红肉），均由河南省农业科学院园艺研究所西瓜甜瓜课题室提供。

1.2 设计

众云18和锦绣于2019年5月在河南现代农业开发研究基地连栋大棚种植，采用常规管理。每个材料种植20株。在甜瓜花期，于开花前一天09：00—11：00取长势健壮无损伤的未授粉子房，带回实验室4 ℃暗处理2 d。2种材料的每一批取样的样本数量相同，每个处理各取30个甜瓜子房，每个处理每个材料分别设置3次重复。

1.3 方法

1.3.1 甜瓜子房消毒灭菌 把2 d暗处理后的子房用流水冲洗0.5～1.0 h，去除子房表面茸毛，洗净后在超净工作台上用70%乙醇消毒30 s，再用无菌水清洗3遍，接着用0.2%次氯酸钠灭菌10 min，最后用无菌水冲洗3～5遍，备用。

1.3.2 改良超低温保存方法建立 （1）预处理：把子房分别进行纵切和横切，放入0.4 mol·L-1的蔗糖溶液中，置于培养间中暗培养8、24、48、72、96 h。（2）包埋：取出预培养的子房，晾干表面液体，用3%海藻酸钠将子房完全包裹，再用0.1 mol·L-1氯化钙固定10 min，取出晾干。（3）加载：把包裹的子房放入加载液（1/2 MS+136 g·L-1蔗糖+180 g·L-1甘油）中，处理20 min，取出晾干。（4）脱水：用PVS2玻璃化液（MS+300 ml·L-1甘油+150 ml·L-1乙二醇+150 ml·L-1二甲基亚砜+136 g·L-1蔗糖）给予30、60、90 min处理，取出晾干。（5）低温保存：用无菌铝箔纸把处理过的子房包裹好迅速放入液氮（-196 ℃）中保存。

1.3.3 低温保存后恢复培养 （1）解冻：将保存0、20、40、60 d的子房放入25、38、40、42 ℃恒温的卸载液（MS+410 g·L-1蔗糖）中解冻5 min，最后再用新卸载液清洗一遍，晾干。（2）接种：将解冻的子房接入诱导培养基中（MS+0.03 mg·L-1 TDZ+0.2 mg·L-1 KT+150 mL·L-1椰汁+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂）。（3）培养：接种后的子房在黑暗条件下，培养箱中34 ℃热激3 d，光照度1500～2000 lx、16 h/8 h光暗周期的培养室中进行培养。（4）恢复培养后甜瓜子房存活率：子房存活率/%=接入子房成活数/接入子房的总数×100。

1.4 数据统计与分析

采用Excel 2016工具进行数据统计、分析和制图，采用SPASS 21软件进行One-way ANOVA法单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 预培养时间对甜瓜子房存活率的影响

预培养可通过减少细胞内含水量和提高细胞分裂分化能力来改善材料的生理状态，提高材料的抗冻性。笔者通过高浓度蔗糖溶液进行预培养来提高超低温保存后材料的存活率。如图1所示，子房预培养的时间不同，超低温保存后子房的存活率也存在差异。随着预培养时间的增加，子房的存活率呈先增高后降低的趋势。预培养8 h时，冷冻20 d后子房的存活率只有55%左右；预培养24 h时，众云18和锦绣的子房存活率分别高达82.30%和82.80%；预培养48 h时，子房存活率开始降到71%左右；预培养72 h时，子房存活率持续降低到50%左右；预培养96 h时，子房存活率低至45%左右。预培养的时间过长易导致细胞过度脱水而造成损伤，进而影响子房的存活率。在0.4 mol·L-1的蔗糖溶液中预培养24 h和48 h时子房存活率的差异不显著，但24 h的预培养极大地缩短了培养时间，所以预培养24 h效果最佳。

2.2 PVS2玻璃化液处理时间对甜瓜子房存活率的影响

超低温保存的程序中玻璃化过程是最关键的环节，其中，玻璃化液处理时间也至关重要。由图2可知，随着PVS2处理时间的增加，子房冻后的存活率逐渐降低。处理30 min时存活率最高，2个甜瓜品种的子房存活率均在82%以上。处理60 min时也均在81%左右，与处理30 min时存活率无显著差异，但都显著高于处理90 min。随着PVS2脱水处理时间的增加，PVS2的毒害作用也逐渐增强，从而导致子房存活率下降。为避免PVS2玻璃液的毒害作用加剧，以30 min为最佳处理时间。

2.3 解冻温度对甜瓜子房存活率的影响

解冻是材料恢复培养最关键的一步，迅速解冻可以避免细胞内再次出现结冰而造成细胞死亡。采用MS+410 g·L-1蔗糖卸载液解冻，分析不同解冻温度对子房存活率的影响，由图3可知，当解冻温度为25 ℃时，子房的存活率远低于50%，随着解冻温度的升高，子房的存活率也随之增高。解冻温度在38 ℃时，子房存活率最高，晚熟品种众云18和早熟品种锦绣都在80%左右；解冻温度在40 ℃和42 ℃时，子房存活率略低于38 ℃，但无显著差异，以38 ℃为最佳解冻温度。

2.4 超低温保存时长对甜瓜子房存活率的影响

理论上材料保存在液氮中保存时间的长短不会影响其存活率。采用改良的超低温保存方法把众云18和锦绣未授粉子房预培养24 h，经过3%海藻酸钠包埋，0.1 mol·L-1氯化钙固定，加载液处理20 min，PVS2脱水30 min，铝箔纸包裹迅速放入液氮中保存。为分析保存时长对材料存活率的影响，将保存了0、20、40、60 d的子房在38 ℃的卸载液中处理5 min进行解冻，再接入诱导培养基中培养，结果如表1所示，0 d时2个甜瓜材料子房的存活率都在92%以上；随着保存时间的延长，子房的存活率也开始降低；保存20、40 d和60 d时存活率在80%～87%之间，子房存活率无显著差异，表明液氮保存时长对冻后子房的存活率无明显影响，且保存60 d时子房的存活率仍在80%以上。