白菜稳定新种质的创制与遗传分析
作者： 邵尤彬 陈纪鹏
摘 要：为了创制白菜新种质和探索白菜杂种后代的遗传特征，采用人工杂交获得矮抗青与黄芽白杂种，再经过连续自交形成植株高大、营养生长旺盛的稳定新种质。通过形态学和细胞学观察研究杂种遗传学特征。结果表明，所获得的新种质营养生长旺盛，叶片肥大，营养器官单株质量大，具有较大生产潜力。通过菌核病抗性鉴定，筛选出具有较好菌核病抗性的植株。分析同源染色体联会规律和染色体分离规律，在第一次减数分裂（MI）终变期，大部分染色体同源配对形成二价体，二价体构型有环状和棒状两种，另外还有四价体等其他构型多价体出现。MⅠ后期，80%以上的花粉母细胞发生10∶10染色体均等分离。两种不同类型的白菜杂交并经多代自交获得减数分裂较正常、育性良好、具有较强菌核病抗性的白菜育种新材料。
关键词：矮抗青；黄芽白；减数分裂；染色体联会
中图分类号：S634.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）07-070-08
Creation of a new germplasm of Chinese cabbage and its genetics
SHAO Youbin， CHEN Jipeng
（Jiangxi Key Laboratory of Crop Growth and Development Regulation/School of Life Science and Environment， Yichun Uniersity， Yichun 336000， Jiangxi， China）
Abstract： The hybrids were obtained by artificial hybridization and a new germplasm of Chinese cabbage with stable characters， tall plants and vigorous vegetative growth were formed by selfing. One of hybrids showed resistance to Sclerotinia sclerotiorum via identification. Chromosome behavior of pollen mother cells （PMCs） in different stages of Meiosis of hybrids was observed. At diakinesis， most chromosomes paired to bivalents as ring and rod configurations. Other chromosomes also formed tetravalents and other multivalents. At anaphase of the first Meiosis， chromosomes segregated as equipartition with 10∶10 in more than 80% of PMCs ， and there were 11∶9 or 12∶8 chromosome equipartition in other PMCs. Chromosomes lagged behind or form anaphase bridges during anaphase separation in a few of PMCs. A new Chinese cabbage breeding material with normal Meiosis， good fertility and strong resistance to Sclerotinia sclerotiorum was obtained by crossing between two different types of B. rapa。
Key words： B. rapa. ‘Aikangqing’; B. rapa. ‘Huangyaba’; Meiosis; Chromosome synapsis
白菜原产于中亚、欧洲和北非等地，栽培历史悠久，遗传资源丰富。多种多样的类型和丰富的种质资源为白菜杂交育种创造了优越条件，近缘种间杂交可将不同类型的优良性状集中于同一杂种后代，获得品质好、产量高和抗性优良的白菜新品种。因此，研究白菜杂种后代减数分裂过程中染色体行为规律对白菜杂交育种、提高白菜品种品质和抗性具有重要意义。
白菜多数种类属于异花授粉植物，遗传组成复杂，具有较强的杂种优势[1]。不同类型间在农艺性状、生长势、抗性和适应性等方面差异较大，通过杂交可实现优势互补与品种改良。例如，不结球白菜不育系与5份自交系杂交选育，杂种后代的多个农艺性状与双亲相比具有较好表现[2]。通过对白菜薹的10个自交单株进行配合力测定，探索出影响白菜薹主要农艺性状的相关遗传因素，所得结果为白菜薹自交系的筛选和品种培育提供了重要依据[3]。白菜的颜色选育也是遗传改良的一个方向，紫心白菜的获得就是将紫色白菜与大白菜杂交，在杂种后代中选择到叶片正面紫色、背面及叶柄绿色的植株[4-5]。白菜黑腐病是一种常见病害，传播途径多样，影响白菜的产量和品质，是由黄单胞菌野油菜致病变种引起的细菌性病害[6]。通过白菜与埃塞俄比亚芥种间杂交已成功地将抗黑腐病性状转入白菜[7]。黄籽沙逊具有早熟、种皮薄、含油量高等黄籽油菜的优点，是用于甘蓝型油菜黄籽性状改良的理想材料[8]。白菜中还有较丰富的抗根肿病资源，在30多份来自国内外的白菜品种中，经过抗病性鉴定，筛选出13份抗性材料[9]。通过种间杂交和分子标记辅助选择，大白菜抗根肿病基因CRb已成功转入不结球白菜[10]和甘蓝型油菜[11]。具有抗根肿病特性的大白菜与普通白菜杂交，再经多代自交和回交，还选育出携带抗性基因的白菜近等基因系，可作为白菜抗根肿病育种的遗传资源[12]。
白菜单倍体减数分裂表现较多异常，第一次减数分裂（MI）前期染色体并不全以单价体形式存在，较多染色体形成二价体甚至三价体，大多数花粉母细胞内出现3对二价体。中期染色体在赤道板位置排列并不整齐，有少部分染色体分布于赤道板以外。减数分裂结束时形成较多的三分孢子[13]。而在白菜的同源四倍体中，花粉母细胞减数分裂时染色体常形成多价体，偶尔形成单价体，并且在减数第一次分裂后期出现不均等分离的现象[14]。白菜与甘蓝型油菜杂种二代发生形态分离，出现了偏白菜的类型和偏甘蓝型油菜的类型以及中间类型。不同类型间染色体数目也不同，偏白菜类型染色体数目为20，减数分裂中平均每个花粉母细胞形成1.64个单价体、9.11个二价体和0.04个三价体。中间类型的植物染色体数目在23～28。偏甘蓝型植株染色体数目在29～38，平均每个花粉母细胞形成0.68个单价体、18.23个二价体和0.30个三价体[15]。 不同类型的白菜杂交获得的杂种染色体数目仍为20，花粉母细胞减数分裂正常，绝大部分细胞形成10个二价体[16]。
当前广泛栽培的白菜品种虽然具有较好的综合性状，但大部分栽培品种的品质还有待进一步提高，多数种类抗病虫特性较差，尤其是菌核病对白菜等十字花科植物危害十分严重。有关白菜杂种减数分裂规律的研究较少，杂种后代的育性改良缺少理论依据。为了研究白菜杂种后代的遗传规律，创建有经济价值的白菜新种质，采用农艺性状具有较大差异的两种白菜作为亲本进行杂交，有望从杂种后代中筛选到农艺性状优良的新材料。两个亲本在形态上存在极大差异，黄芽白形体大，叶色白，结球性好；而矮抗青形体较小，叶色暗绿，不结球，二者具有很好的互补性。通过减数分裂过程观察，探索杂种细胞遗传学规律，找出减数分裂过程与花粉育性之间的关系，并对杂种后代进行菌核病抗性鉴定，为白菜杂交育种创建新材料提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
矮抗青与黄芽白属于十字花科芸薹属植物，在进化和农业生产中形成不同的变种，在形态学方面有较大差异，具有不同的食用价值。黄芽白叶片大，易结球，单株质量大，不易抽薹；而矮抗青叶片肥厚，不结球，较易抽薹，单株质量较小。二者生长习性相近，都表现为生育期较短，不耐阴雨潮湿。2015年秋季，亲本露天播种，第二年春季盛花期进行人工杂交并收获种子，经鉴定获得杂种一代。黄芽白作母本的杂交记为正交，杂种一代记作F1。以矮抗青为母本的杂交记为反交，杂种一代记作F'1。正反交杂种一代经过多代连续自交，于2020年形成稳定新种质F5和F'5（图1）。将杂种后代在田间种植，开沟起垄，行距30 cm，株距20 cm，冬季做好排水工作。分别在2017年和2021年春季观察杂种F1、F'1和F5、F'5花粉育性、植株表型和花粉母细胞减数分裂特征，并于2021年春季进行抗菌核病特性鉴定。
1.2 方法
1.2.1 人工杂交 2016年春季，于白菜盛花期，选择无明显病虫害、生长健壮的植株作母本，用镊子将即将开放的花蕾剥开去除雄蕊，然后套上杂交专用纸袋。翌日上午取父本花粉为母本授粉。授粉后7 d左右去掉纸袋，让其自然生长，待种子成熟后收取种子。
1.2.2 花粉育性观察 选择天气晴朗、气温较高时间段，一般在上午10：00花粉活力最强，适合观察花粉育性。在田间取新开的花朵，每个材料选3株，每株取5朵花用于观察。从花朵中取1～2枚花药放于载玻片上并用镊子挤破花药，立即加1～2滴醋酸洋红，用盖玻片盖好轻轻按压，然后放在显微镜（Nikon Eclipse 80i，日本）下观察。饱满、圆形、形体大、被染色程度深的为有活力花粉，反之则是无活力花粉。花粉育性以所观察的可育花粉占总观察花粉数的百分比表示。
1.2.3 杂种后代形态学观察 将亲本和杂种后代种植于田间，在幼苗期（10片真叶）观察幼苗叶片形态特征。在终花期观察株型并统计分枝数量以及花器官各部分特征。成熟期统计植株结实情况，植株结实性以单株形成角果数和单角果结实数反映，单株结实数=单株角果数×每角果种子数。
1.2.4 花粉母细胞减数分裂观察 选择晴好、气温较高天气，上午11：00左右取发育阶段适宜的花蕾，使用固定液（V无水乙醇∶V冰乙酸=3∶1）处理迅速杀死细胞，使染色体保持原有形态。将花蕾在固定液中处理24 h以上，于-20 ℃冰箱中贮藏。从花蕾中取出花药于1 mol·L-1的HCl溶液中，60 ℃水浴2 min，可有效去除细胞质干扰，观察染色体更清晰。然后将花药放在载玻片上用镊子压碎，再除去花药壁，滴加卡宝品红，盖上盖玻片，在光学显微镜（Nikon Eclipse 80i，日本）下观察。重点观察处于减数分裂不同阶段的花粉母细胞染色体行为，选取典型细胞拍照记录。
1.2.5 菌核病抗性鉴定 采用PDA培养基培养菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）病原菌，在25 ℃培养箱中培养，待菌丝长满培养皿后即可接种。选择菌核病高发阶段（白菜盛花期）进行茎秆接种，先在茎秆上钻小孔，再用牙签蘸些带有菌丝的培养基小块，将牙签插入小孔中，并用保鲜膜包扎防止雨淋或风干。每个材料随机选择5株，每株接种3个点，以当前主栽白菜品种丰抗90作为对照。分别于接种后7、10 d观察病斑大小，以沿茎秆病斑长度L为指标反映感病程度。测量结果与对照比较计算相对感病度S，即S=L/L对照，S值越大表示感病度越高（抗病性越弱），S值越小表示感病度越低（抗病性越强）。