新型接触性病毒牛结节性皮肤病诊断与防控措施的详细探讨
作者: 罗桑尖措
牛结节性皮肤病又被称为牛结节疹,是由牛结节性皮肤病毒引发的以全身体表皮肤出现结节病变为主要特征的病毒性传染性疾病。该种疾病通过牛和相关制品的运输向着全国各地蔓延,在各个省份相继报告了结节性皮肤病疫病。从致死率来看牛结节性皮肤病造成的整体死亡率相对较低,但是该类疾病发病周期较长,传播速度相对较快,发病之后会导致繁殖母牛出现不孕流产,种公牛出现不育,同时还会降低奶牛的泌乳量和肉牛的生产性能,损坏牛皮,病情加重之后还很容易继发感染细菌性疾病和其他病毒性疾病,使得疾病的诊断难度加大,养殖效率逐渐下降,给牛养殖业造成极大的经济损失。作为饲养管理人员应该对牛结节性皮肤病的危害有所认知,要明确该类疾病的流行特点和诊断方法,提前采取措施进行有效地防控,降低发病率,确保养殖安全。本次研究就牛结节性皮肤病的诊断与防控措施进行详细的探讨与分析,希望对广大同行有所借鉴与帮助。
一、牛结节性皮肤病的流行病学
1、牛结节性皮肤病的病原学
牛结节性皮肤病病毒属于痘病毒科山羊豆痘病毒属的成员,已知有Ⅰ型(广泛分布)、Ⅱ型(非洲)、Ⅲ型(中亚)。该类病毒形态特征呈现砖形或卵形,长度230~270nm,宽度140~200nm,具有包膜和中心核心,表面有杆状结构。病毒对干燥和高温相对稳定,可以在痂皮和土壤中存活数月,对酸性条件敏感。氯仿等有机溶剂不灭活病毒,病毒对热敏感,56℃加热30min可灭活病毒,对紫外线和γ射线敏感,对某些消毒剂敏感,如次氯酸钠和季铵化物。该类病毒宿主范围窄,主要感染牛,通过接触感染性物质(例如痂皮或唾液)传播,在牛群中引起严重的结节性皮肤病。
2、牛结节性皮肤病的致病机理
牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的致病机制涉及病毒与宿主细胞的相互作用和病毒复制过程中的免疫逃避。LSDV通过皮肤伤口或黏膜进入宿主,病毒与靶细胞表面的受体结合,例如痘病毒受体A33R。病毒进入细胞后,其外膜融合,释放核心到细胞质中,核心释放病毒DNA,并在细胞质中复制。LSDV在动物细胞当中能够编码多种免疫调节蛋白,可以抑制宿主的免疫反应。常见的蛋白质主要有E3L蛋白抑制宿主细胞的凋亡,为病毒复制提供有利环境。B22R蛋白抑制主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的表达,从而逃避细胞毒性T细胞的识别,同时结节性皮肤病毒还能够干扰牛体内干扰素的产生。LSDV复制导致靶细胞肿胀和破裂,释放病毒颗粒和细胞碎片,细胞损伤和炎症反应导致结节形成,结节主要发生在皮肤、淋巴结和呼吸道等部位。LSDV持续复制和释放新的病毒颗粒,逃避宿主的免疫反应,病毒表面蛋白的抗原变异也可能有助于其逃避免疫识别。
3、牛结节性皮肤病的流行特点
牛结节性皮肤病是一种由疙瘩皮肤病病毒引起的牛的传染病,传染源是感染牛以及病牛的结节液、唾液、血液和粪便。病毒主要通过吸血昆虫(如蚊、蝇、蠓、虻、蜱等)的叮咬传播,也可通过相互舔舐或舔舐发病牛的结痂进行传播,食入被感染动物唾液污染的饲料和饮水也是传播途径之一。该种疾病目前没有特定的易感群体,所有牛都应该被认为是潜在的易感者,尤其是幼牛和未经免疫的成年牛。从流行季节来看结节性皮肤病在温暖湿润的季节更为流行,特别是在雨后,昆虫活动频繁时,夏季和秋季是疾病的高发期。在很多养殖场中牛结节性皮肤病是由疙瘩皮肤病病毒引起的慢性、亚急性或急性传染病,病毒可能通过感染牛的唾液进入体内,引起病毒复制和感染,再加上养殖管理不当患病牛群和健康牛群频繁接触,从而造成疫病扩散蔓延。
二、牛结节性皮肤病的临床症状
牛结节性皮肤病潜伏期因不同病毒株和牛只的免疫状态而异,通常为7~21d,但也有报告指出部分病例的潜伏期可长达28d。初期阶段患病牛出现轻微的体温上升,但尚无明显的皮肤病变。随后牛只体温急剧上升,可达41℃以上,出现抑郁、厌食、消瘦等症状。眼结膜和鼻黏膜可能出现炎症,牛只会有大量唾液分泌,在体温升高后的48h内,皮肤开始出现病变。病情加重之后再患病,牛的病变皮肤出现直径2~4cm的坚实、圆形结节,开始时可能局限于头颈、四肢、乳房、生殖器和会阴部,随后可能扩散至全身,结节可能破溃、坏死,并最终纤维化,这个过程可能持续数月,部分小结节可能自行消退。发病后期结节干瘪、脱落,留下疤痕,脱落后的皮肤上可能存活有病毒,导致持续的感染状态。病情严重之后,由于出现继发性感染,如肺炎和乳腺炎,导致牛只消瘦、生产性能下降,恢复缓慢。怀孕母牛可能出现流产或长时间不发情,犊牛可出现全身性结节,且症状可能更为严重。
三、牛结节性皮肤病的病理学变化
病死牛解剖之后皮肤病变是牛结节性皮肤病的主要特征,病变初期,皮肤出现红斑、瘙痒,随后出现结节,结节呈圆形或椭圆形,直径约1~2cm,表面光滑,质地坚硬。随着病情发展,结节逐渐增大,数量增多,相邻结节融合,形成大的结节,严重时,皮肤表面出现溃疡、坏死,甚至脱落。肿大部位短淋巴结肿大、充血,随后出现炎症细胞浸润,随着病情发展淋巴结发生坏死、液化,形成脓肿,脓肿破裂后,形成瘘管,排出脓液。另外,病毒还可以侵犯内脏器官,如肺、脾、肾等,导致内脏器官充血、水肿,随后出现炎症细胞浸润。随着病毒的入侵内脏器官发生坏死、纤维化,导致功能减退或丧失。
四、牛结节性皮肤病的实验室诊断
1、牛结节性皮肤病的病毒中和试验
在病毒综合实验过程中,需要提前准备好牛结节性皮肤病病毒分离株、牛结节性皮肤病病毒阳性免疫血清、牛结节性皮肤病病毒阴性血清、细胞培养体系(Vero细胞或MDBK细胞)、细胞培养基、培养板、移液器、混匀器、孵箱。实验操作期间首先将病毒分离株稀释至合适的滴度,通常为100TCID50/0.1mL,然后将阳性和阴性血清分别稀释预处理为1∶10,将病毒稀释液与血清稀释液等体积混合,并混匀,病毒与血清混合液在37℃下孵育1h,将孵育后的混合液接种到细胞培养板中,细胞培养板在37℃下培养5~7d。实验结束之后观察细胞培养板中是否存在细胞病变效应(CPE),如细胞融合、变圆、脱落等,紧接着计算病毒在细胞培养中的TCID50,即引起50%细胞病变的病毒稀释倍数,然后计算中和滴度,即病毒稀释液中能被血清中和90%CPE的血清稀释倍数。中和滴度=病毒稀释倍数×(1+血清稀释倍数),阳性免疫血清的中和滴度较高,表明血清中含有针对病毒的中和抗体显示为阳性。阴性血清的中和滴度较低或不存在,表明血清中不含有针对病毒的中和抗体显示为阴性。如果中和滴度介于阳性和阴性结果之间,表示为可疑,需要进一步检测或重复试验以确认结果。
2、牛结节性皮肤病的酶联免疫吸附试验
正式实验操作之前需要准备好牛结节性皮肤病病毒抗原、牛结节性皮肤病病毒阳性血清、牛结节性皮肤病病毒阴性血清、96孔ELISA板、阻断液、洗涤液、二抗酶标试剂、底物溶液、终止液、酶标仪。实验操作步骤是,将病毒抗原稀释至1∶20浓度,加入ELISA板孔中,4℃过夜,用洗涤液洗涤ELISA板,去除未结合的抗原,加入阻断液孵育,以阻断非特异性结合位点,紧接着加入样品(血清稀释液)并孵育,使抗体与抗原结合,然后再次洗涤ELISA板,去除未结合的抗体,紧接着加入二抗酶标试剂,其与样品中的抗体结合,再次洗涤ELISA板,去除未结合的二抗酶标,向其中加入底物溶液,使二抗酶标显色,最终加入终止液,停止酶促反应,使用酶标仪在特定波长(通常为450nm)下读板。计算方法是样品/阳性对照(S/P)比值=样品吸光度值/阳性对照吸光度值,当S/P比值≥0.5阳性结果,表明样品中存在针对牛结节性皮肤病病毒的抗体,S/P比值<0.5阴性结果,S/P比值介于0.2和0.5之间疑似结果,需要进一步检测或重复试验以确认结果。
3、牛结节性皮肤病的荧光聚合酶链式反应
实验操作过程中涉及的试剂和设备主要有牛结节性皮肤病病毒特异性引物、qPCR试剂盒、样品DNA、阳性对照DNA、阴性对照DNA、qPCR仪。根据qPCR试剂盒说明配制反应混合物,包括引物、探针、DNA聚合酶和其他试剂。其中引物用于扩增LSD病毒基因组特定区域的DNA序列,设计应基于已知的LSD病毒基因序列,以确保特异性。引物的序列和浓度应根据实验需求确定。探针通常标记有荧光染料如FAM、ROX等,以便在PCR仪器上进行实时监测,探针的序列应与扩增产物中的特定序列互补。DNA聚合酶是PCR反应的核心酶类,用于在PCR过程中合成新的DNA链,通常使用热稳定DNA聚合酶,如Taq聚合酶。缓冲液用于提供适宜的反应环境,维持酶的活性和稳定性,根据所使用的PCR反应体系和DNA聚合酶的要求确定。dNTPs即脱氧核糖核苷酸三磷酸盐,是PCR反应的原料,用于合成新的DNA链。MgCl2镁离子是DNA聚合酶的辅助因子,对PCR反应的扩增效率有重要影响,MgCl2的浓度通常在0.5~2.0mM之间优化。将样品DNA、阳性对照DNA和阴性对照DNA加到反应混合物中,反应混合物转移到qPCR仪中,根据试剂盒说明进行扩增,利用qPCR仪记录每个扩增周期的荧光信号。样品扩增曲线呈指数增长,且扩增阈值(Ct)值低于阳性对照的Ct值表示为阳性,样品没有明显的扩增曲线,或扩增曲线呈线性增长,且Ct值高于阳性对照的Ct值表示为阴性,样品的Ct值介于阳性和阴性结果之间,或扩增曲线呈弱阳性表示可疑需要进一步检测或重复试验以确认结果。
五、牛结节性皮肤病的疫病处置
我国针对牛结节性皮肤病这类动物疫病的处置主要依据相关法规、规章和标准进行。同时还需要详细执行《动物疫病报告制度》《动物防疫技术规范》《牛结节性皮肤病防治技术规范》《动物及其产品检疫规程》《病害动物及其产品无害化处理规程》《动物防疫设施建设标准》。发现牛结节性皮肤病的疫病后,应立即向当地动物卫生监督机构报告,包括疫病发生的时间、地点、规模、症状、疑似病因等。当地动物卫生监督机构接到疫病报告后,应立即组织专业人员进行诊断确认,通过临床症状观察、病理组织学检查、病毒分离鉴定来判定病情。对确诊的牛结节性皮肤病疫病,应立即采取隔离和封锁措施,将病牛及其接触过的牛只进行隔离,限制牛只流动,防止疫病扩散,对病牛及其接触过的牛只进行采样检测,采集血液、皮肤病变组织等样本,进行病毒检测和血清学检测。检测阳性的病牛,应立即进行扑杀,采用掩埋或者焚烧处理方法进行无害化处置,防止疫病扩散。对疫病发生场所及其周边环境进行消毒,坚持每天上午下午各消毒一次,推荐使用2%的过氧化氢、2%~5%的氢氧化钠溶液、0.1%的过氧乙酸溶液,生石灰5%~10%的漂白粉溶液,加强动物防疫设施建设,提高防疫能力。疫病处置之后,应该对所在地区的牛结节性皮肤病疫病进行持续监测和评估,掌握疫病动态,及时调整防疫措施。扑杀完成30d内禁止疫病所在县域的牛调出,各地在检疫监督过程中,应该加强对牛结节性皮肤病的临床症状检查和血型检测。同时要进一步加强疫病溯源,对疫病发生前30d内引入本地区的牛和相关品种进行严格的溯源调查,分析疫病的主要来源,当有明确证据表明是输入牛引发的疫病之后应该对输出地牛群进行针对性的隔离观察和样品采集,开展流行病学调查,并严格落实疫病处置方案和卫生消毒方案。
六、牛结节性皮肤病的预防措施
1、疫病所在区和相邻区域的紧急免疫接种
疫病所在地区和相邻的县域所有牛养殖场应该选择国家批准的山羊痘疫苗进行紧急免疫接种,接种剂量为山羊接种量的5倍,并在免疫接种7~14d之后,对牛群进行抗体水平监测,保证抗体水平达标。
2、预防期间对外引种规范化
在预防期间,对外引种需要严格执行国家标准和引种检疫规程,以防止疫病传入。在引进牛只前,选择有良好信誉、具备合法资质的引种单位或个人进行引种,对引进地进行全面了解,掌握当地的动物疫病、兽医防疫措施等信息,与引进地的兽医部门沟通,了解当地的检疫规定和标准,确保引进的牛只来源可靠,遵循相关法律法规。同时,及时向当地动物卫生监督机构申报,并提供牛只的来源、数量、品种、年龄、性别等信息。引进的牛只应在指定的隔离场所进行隔离观察,观察期一般为45d,在隔离期间,对牛只进行健康检查,采集血液、唾液、鼻咽拭子等样本,进行病毒检测、血清学检测等,根据检疫结果,对牛只进行相应的防疫措施。如接种疫苗、进行疫病治疗等。经过隔离观察、疫病检测和防疫措施后,对符合要求的牛只进行审批,办理相关手续,予以放行。
3、加强环境清理卫生消毒
在疫病防控期间,养殖场环境清理消毒至关重要,消毒期间应该详细地评估疫病严重程度、受感染动物数量、潜在的传播途径,确定需要隔离和处理的区域,并要加强人员培训确保他们了解疾病、消毒程序和自身安全防护。选择使用高效的消毒剂如10%的氢氧化钠溶液、5%~10%的漂白粉,并准备足够的消毒剂,以满足全场消毒的需要。确定清理时间表,确保所有受感染动物被移除,先使用高压水枪清洗牛舍、设备、围栏等,清理牛舍内的粪便、垫料等有机物,紧接着使用高压水枪喷洒消毒剂,确保所有表面都被覆盖,对于难以清洁的表面和设备,使用消毒剂进行浸泡或喷洒,在消毒后,再次使用清水清洁所有表面,确保所有区域完全干燥,以防止消毒剂残留造成伤害。消毒期间还是要详细地记录所有消毒过程,明确消毒剂种类、浓度、时间,监控消毒效果,确保消毒彻底,消毒后,实施有效的生物安全措施,防止疾病再次传入。
综上所述,牛结节性皮肤病是近年来传入我国的一种新型的接触性病毒性传染性疾病,目前已知该种病毒只能感染牛,包括了多种类的牛,发病率在30%~60%之间,死亡率在1%~10%。一旦受到疾病感染,养殖户会面临较为严重的经济损失,所以需要饲养管理人员提高重视程度,要注重加强流行病学调查,明确该种疾病简单有效的诊断方法,并加强生物安全防范,对于患病牛应该立即进行扑杀处理,未发病牛群应该持续进行血清检测,并进行紧急免疫接种,保证抗体水平达标,有效切断病原传播渠道,确保养殖安全。
(作者单位:814000青海省果洛州动物疫病预防控制中心)