不同叶龄青海云杉针叶内生真菌多样性研究

摘 要：为寻找可能导致青海云杉感染顶芽锈病的原因，采用高通量测序技术对两组1龄和2龄青海云杉针叶进行测序，分析其内生真菌多样性和群落结构变化。结果显示，6个样本共得到407个可以用于物种分类的运算分类单位（Operational Taxonomic Units，OTU），其中1龄针叶特有OTU数为16个，2龄针叶特有OTU数为20个，共有OTU数为93个。经Alpha多样性分析发现，2龄针叶内生真菌丰富度和多样性略高于1龄针叶，群落结构相对稳定，更有利于抵御病原菌侵染；两组样本的群落结构差异较为明显，其中1龄针叶组优势菌群为Kabatina和Aspergillus，2龄针叶组各菌群占比相差不大，没有明显优势菌群。经Bata多样性分析发现，两组样本间的不同重复分别聚在一起，相似性较高。初步推测，1龄针叶中Aspergillus真菌优势生长导致其内生真菌群落结构失衡，对针叶造成了一定的损害。

关键词：青海云杉；高通量测序；内生真菌；多样性；群落结构

中图分类号：S791.18 文献标志码：A 文章编号：1674-7909（2023）03-108-4

0 引言

青海云杉（Picea crassifolia Kom.）是松科云杉属高大常绿针叶乔木，是我国特有树种，主要分布在青海省、甘肃省、宁夏回族自治区及内蒙古自治区等西北干旱地区，在造林绿化、涵养水源等方面发挥着重要作用。青海云杉主要生长于海拔1 700～3 000 m的阴坡山地，具有极强的耐寒、耐旱性，是组成高原森林系统最主要的树种之一。目前，学者对青海云杉的研究多见于病虫害防治［1-3］、育苗造林［4-6］等，还有不同生长状态针叶内生真菌多样性［7］及根系内生真菌多样性［8］等研究。近年来，青海省海东市互助县南门峡林区青海云杉顶芽锈病发生严重，导致云杉及林区生态平衡受到严重影响。在调查中发现，顶芽锈病病原菌只侵染新生针叶，对多年生针叶不具有侵染性。针对这一现象，笔者采用高通量测序技术，从植物内生真菌角度出发探索健康青海云杉新生针叶（1龄针叶）和2龄针叶内生真菌多样性和群落结构变化，寻找其内生真菌与顶芽锈病病原菌之间的相关性。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

研究样本于2022年7月中旬采集自互助县南门峡林区（东经101°53′17″E、北纬36°59′11″）。在3个不同林班采集青海云杉健康新生针叶（1龄针叶）与2年生针叶（2龄针叶）作为试验样本，其中1龄针叶样本分别命名为H1、H2、H3，2龄针叶样本分别命名为F1、F2、F3，采集的样本用冰盒保存带回实验室。在超净工作台对样本进行表面杀菌消毒处理，具体步骤如下。先依次将样本在75%乙醇溶液中浸泡1 min，而后在5%次氯酸钠溶液中浸泡5 min，最后用无菌水冲洗干净，并用灭菌后的滤纸吸干水分。为尽量减小试验过程中产生的误差，将杀菌消毒后的样本放置于液氮中进行速冻处理。试验所用仪器和试剂如表1所示。

1.2 样本DNA提取及PCR扩增

样本基因组DNA采用CTAB法进行提取，使用引物18S-R（5’-GTAACCCGCTGAACCTCC-3’）和18S-F（5’-GTCCGAAGACCTCACTAAATCA-3’）进行18S片段扩增。PCR反应体系（50 μL）：2x Premix Taq 25 μL，引物18S-R和18S-F各1 µL，DNA模板50 ng，ddH2O补加至50 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，将纯化后的扩增产物送往广东美格基因科技有限公司测序。

1.3 测序数据分析

利用Illumina HiSeq 2500测序平台进行测序，将得到的数据用FLASH v1.2.7软件进行拼接、过滤优化，得到优化序列（Tags）；再利用Usearch软件对Tags在97%的相似度水平下进行聚类，获得运算分类单位（Operational Taxonomic Units，OTU）数量。基于OTU丰度表，利用usearch-alpha_div进行Alpha多样性分析，再利用R软件的prcomp函数进行Bata多样性分析，最后进行共有及特有物种统计、群落组成分析。

2 试验结果与分析

2.1 测序数据基本情况

由表2可知，6个样本测序共获得481 023对Reads，双端Reads拼接过滤后共产生427 613条有效序列，有效序列数占比超过87.72%，且GC含量为49.1%，Q30含量大于97.6%，表明测序数据质量较好，碱基错误率较低。

稀释性曲线可以反映测序深度及物种丰富程度。由图1稀释性曲线可知，随着样本测序条数增加，稀释性曲线表现为先急剧增加，随后逐渐趋于平缓，表明测序样本包含绝大多数的微生物物种信息，测序结果可以反映青海云杉针叶内生真菌群落结构。

6个样本在97%的相似度水平下进行聚类，共获得407个可以用于物种分类的OUT，其中H1、H2、H3、F1、F2、F3的OUT数分别为66、66、68、67、72、68个，且H组特有OTU数为16个，F组特有OTU数为20个，两组样本共有OTU数为93个（见图2）。其中，共有OTU数占H组和F组OTU数的比例分别为82.3%和85.3%。共有OTU数较多，表明两组样本内生真菌群落结构相似性较高。

2.2 内生真菌Alpha多样性分析

Richness和Chao1指数表示物种丰富度，香农指数与物种多样性呈正相关，辛普森指数与物种多样性呈负相关。由内生真菌群落Alpha多样性指数统计结果可知，H组样本Richness和Chao1指数除H2外均低于F组样本，H组样本辛普森指数均低于F组样本，但两组样本香农指数差异不明显（见表3）。由此可见，F组样本内生真菌多样性与丰富度略高于H组，其内生真菌群落结构相对稳定。

2.3 群落组成分析

利用QIIME软件对获得的OTU在不同分类水平上进行注释分类。由图3可知，在门水平上，相对丰度较高的内生真菌种类共注释到了3个门，分别是子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和被孢霉菌门（Mortierellomycota）。其中，H组中Basidiomycota占比3.88%，Ascomycota占比44.71%；F组中Basidiomycota占比19.98%，Ascomycota占比37.22%。Mortierellomycota在两组样本中占比均不超过1%，其他未被注释菌群（Unassigned）占比较高。

由图4可知，在科水平上，两组样本相对丰度较高的物种有（Dothioraceae）、（Aspergillaceae）、（Taphrinaceae）、丛赤壳科（Nectriaceae）、（Mrakiaceae）、格孢腔菌科（Pleosporaceae）、（Sporidiobolaceae）及（Tremellaceae）。除了未被注释的菌群外，Dothioraceae、Aspergillaceae、Taphrinaceae等菌群占比相对较高。H组中占比较高的优势菌群是Dothioraceae和Aspergillaceae；F组中占比较高的优势菌群主要是Taphrinaceae。上述3科菌群在两组样本中占比差异较明显。

由图5可知，在属水平上，两组样本相对丰度较高的物种有Kabatina、曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）、Udeniomyces、匍柄霉属（Stemphylium）、Rhodosporidiobolus、丝状担子菌属（Filobasidium）及隐球酵母属（Cryptococcus）。H组优势菌群为Kabatina和Aspergillus，其余菌群占比均较低；F组中除了未被注释的菌群外，其余菌群相对丰度较为平衡，各属菌群占比相似，没有明显优势菌群。在属水平上，两组样本差异较为明显，主要体现在Kabatina和曲霉属（Aspergillus）上，这两种菌群在H组中相对丰度明显高于F组。

2.4 Beta多样性分析

利用QIIME软件对两组进行Beta多样性分析，比较不同样本间物种多样性的相似程度（见图6）。由PCoA分析可知，第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）分别可以解释所有的变量的64.9%和15.3%，共解释变量的80.2%。H组（1龄针叶）和F组（2龄针叶）中的3个样本分别聚在一起，组内内生真菌群落差异不明显，相似性高。

3 结论与讨论

利用高通量测序技术对1龄和2龄青海云杉针叶的6个样本进行内生真菌多样性分析，发现2龄针叶内生真菌多样性与丰富度略高于1龄针叶，菌群结构相对稳定，更有利于抵御外来病原菌侵染；两组样本优势菌群存在明显差异，H组样本中Kabatina和Aspergillus为明显优势菌群，F组样本中各属组成占比相对均衡，没有明显差距。有研究结果显示，Aspergillus属多种真菌会对植物造成病害，如水稻稻曲病［9］、武夷岩茶赤叶斑病［10］、苹果黑点病［11］等。尚未发现与Kabatina相关的研究文献，该属真菌作用尚不明确。初步推测，青海云杉新生针叶内生真菌中Aspergillus占比较高，导致其内生真菌群落结构失衡，可能对新生叶造成一定损害，加之新生针叶表皮细胞尚未发育成熟，在应对锈病病原菌侵入时没有建立良好的抵御屏障；在这一系列因素的共同作用下，青海云杉顶芽锈病病原菌更易侵染新生针叶。此次研究中的PCoA结果显示，两组样本中的3个重复聚在一起，相似性高，数据结果合理、可靠。

参考文献：

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