基于SSR标记的广西壮族自治区柑橘主栽品种遗传多样性分析

摘 要：为探明广西壮族自治区柑橘主栽品种的遗传多样性，利用21对简单重复序列（Simple Sequence Repeats，SSR）标记引物对7个柑橘品种的基因组脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）进行分析，研究各种间的遗传亲缘关系及遗传距离。试验结果表明：利用21对SSR引物对7个柑橘品种的基因组DNA进行扩增，共获得172条谱带，平均每个引物扩增出8.19条谱带，其中多态性条带数量为136，多态性比率为79.07%；7个柑橘品种间的遗传相似系数为0.000～0.786，平均值为0.529；根据聚类分析结果，7个柑橘品种在遗传相似系数为0.513处可以分成四大类群。这说明7个柑橘品种具有丰富的遗传多样性，SSR分子标记技术可以较好地揭示柑橘品种之间的遗传差异和亲缘关系。

关键词：柑橘；SSR标记；遗传多样性

中图分类号：S566.1 文献标志码：B 文章编号：1674-7909（2023）12-93-4

0 引言

柑橘是我国广泛种植的一种常见水果，近年来柑橘产业飞速发展，人们对其的需求量与日俱增。广西壮族自治区（以下简称广西）自然条件优越，十分适宜柑橘生长，是我国柑橘的主要产区之一。通过多年的引种育种，广西柑橘品种繁多，遗传多样性丰富，但这导致品种区分难，进化起源问题极其复杂。在此背景下，研究柑橘品种的遗传多样性对柑橘品种区分及种质资源的搜集保存、鉴定评价具有重要意义。

脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）分子标记技术广泛应用于植物遗传多样性和种质鉴定研究，常用的DNA分子标记有简单重复序列（Simple Sequence Repeats，SSR）标记、随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）标记、单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）标记等。其中，SSR分子标记技术具有稳定性高、操作简单、方便快捷等特点，被广泛应用于植物遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、辅助育种、遗传图谱构建等领域［1-3］。例如，刘通等［4］利用SSR分子标记技术对广西野生柑橘品种、地方品种及对照品种进行了遗传多样性研究，利用22对SSR引物对34份不同的材料进行了分析，产生了221条多态性条带。吴娟莉等［5］利用23对SSR引物对38份金柑及其近缘属种质进行分析，扩增得到265条有效性条带、250条多态性条带，多态性比率为92.99%。马丽丽等［6］利用11对SSR多态性引物对17份早花柠檬材料进行分析，共检测出92个等位变异，平均每对引物检测出8.5个等位变异，同时在遗传相关系数为0.65处将17份材料分为4个类群。相关研究表明，SSR分子标记技术是研究植物遗传多样性的有效方法之一［7-11］。基于此，笔者利用21对具有较好多态性的SSR引物对广西7个柑橘主栽品种的遗传多样性进行研究，探讨各品种间的遗传亲缘关系及遗传距离，以期为柑橘的遗传育种研究提供更多理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 供试品种

试验共采用7个柑橘栽培品种，分别为贡柑、沃柑、金橘、砂糖橘、夏橙、沙田柚、茂谷柑。

1.2 SSR引物

试验共选用21对SSR引物，引物序列由《柑橘属品种鉴定 SSR分子标记法》（NY/T 3436—2019）提供，由金斯瑞生物科技股份有限公司合成（见表1）。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA提取。笔者于2022年10月从广西壮族自治区农业科学院的柑橘种植基地进行取样，分别从7个柑橘品种植株上各取3片叶，分别提取各品种叶片DNA：将叶片去除中脉后用剪刀剪取中间部分，剪碎后混匀放入研钵中，加入适量液氮直至研磨成粉末状，取100 mg置于1.5 mL离心管中，加入1%改良十六烷基三甲基溴化铵（Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide，CTAB）缓冲液750 µL，涡旋振荡混匀后于65 ℃水浴45～60 min，加入三氯甲烷500 µL，颠倒混匀，12 000 r/min离心5 min，转移上清液约0.5 mL至新离心管中，加入等体积（0.5 mL）预冷至4 ℃的无水乙醇，颠倒混匀，-18 ℃冰箱下静置1 h，12 000 r/min离心3 min，去上清液，于室温下干燥沉淀，最后加入Tris-EDTA（TE）缓冲液50 µL，于18 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）。PCR反应体系见表2。

PCR程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，60 ℃（具体退火温度由不同的引物决定）退火40 s，72 ℃延伸45 s（根据扩增片段的长度做出适当调整），共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.3 电泳检测。用8%聚丙烯酰胺混合液制作凝胶，将凝胶固定于电泳槽中，对PCR产物进行电泳检测，最后用扫描仪扫描胶片，保存结果。

1.4 数据处理

在数据统计与分析中，每对SSR引物检测1个位点，视每条多态性带为1个等位基因；将观测到的每条带视为1个性状，有此带时赋值为“1”，无此带时赋值为“0”，所有数据处理使用NTSYSpc2.02软件完成。

2 试验结果与分析

2.1 7个柑橘栽培品种基因组DNA的遗传多样性

由表3可知，21对SSR引物共扩增出172条谱带，其中多态性条带数量为136，多态性比率为79.07%，扩增出的条带相对分子量均小于500 bp，平均每对引物扩增出8.19条谱带，平均每对引物扩增出的多态性条带数量为6.48。这表明7个柑橘栽培品种间具有丰富的遗传多样性，SSR分子标记技术可以有效揭示供试柑橘品种间的遗传差异和亲缘关系。

2.2 7个柑橘栽培品种基因组DNA的遗传相似性

由表4可知，7个柑橘栽培品种间的遗传相似系数为0.000～0.786，平均值为0.529。其中，金橘与夏橙的遗传相似系数最大（0.786），表明金橘与夏橙的遗传距离相对较近；贡柑与砂糖橘、贡柑与茂谷柑的遗传相似系数最小（均为0），表明贡柑与砂糖橘、贡柑与茂谷柑的遗传距离相对较远。

2.3 7个柑橘栽培品种聚类分析

由图1可知，在遗传相似系数为0.513处，可以把7个柑橘栽培品种分成四大类群。第一类群仅有贡柑，第二类群包括沃柑、沙田柚、金橘、夏橙，第三类群仅有砂糖橘，第四类群仅有茂谷柑。在遗传相似系数为0.571时，第二类群又能分成2个亚群，第一亚群包括沃柑、沙田柚，第二亚群包括金橘、夏橙。第二类群的各柑橘品种间遗传相似系数相对较大，表明沃柑、沙田柚、金橘、夏橙的遗传距离较近；其中金橘与夏橙的遗传相似系数最大，表明金橘与夏橙的遗传背景最相似，两者的亲缘关系最近。

3 结论与讨论

近年来，柑橘作为区域特色经济林木在广西广泛推广种植，已成为广西乡村振兴、农民增收致富的重要产业。目前，广西栽培的柑橘品种以砂糖橘为主，其他品种有沃柑、脐橙、茂谷柑、贡柑、金橘等。利用SSR分子标记技术对广西柑橘主栽品种的遗传多样性进行分析，可为柑橘的遗传育种提供参考。

此次试验结果表明，21对SSR引物共扩增出172条谱带，其中多态性条带数量为136，多态性条带比例为79.07%，表明7个柑橘品种间具有丰富的遗传多样性；7个柑橘品种间的遗传相似系数为0.000～0.786，平均值为0.529。其中，金橘与夏橙的遗传相似系数最大（0.786），表明金橘与夏橙的遗传背景最为相似，亲缘关系最近；贡柑与砂糖橘、贡柑与茂谷柑的遗传相似系数相对较低，亲缘关系较远。

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