禽腺病毒研究进展

［摘 要］ 禽腺病毒主要采用疫苗免疫与卵黄抗体防治相结合的方式进行防控。通过总结禽腺病毒的分类、传播、病原性、致病性、诊断和防治等方面的研究进展，对我国兽药企业的禽腺病毒疫苗及卵黄抗体研发情况进行简要分析，为禽腺病毒疫苗及卵黄抗体的临床应用及研发布局提供依据。

［关键词］ 禽腺病毒；诊断；疫苗；卵黄抗体

［中图分类号］ S852.65 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1674-7909（2022）03--3

0 引言

禽腺病毒（Fowl Adenovirus，FAdV）属于腺病毒科，为双链DNA病毒，是一种常见的禽致病性病原体，可引发鸡群感染包涵体肝炎（Inclusion Body Hepatitis，IBH）及心包积水综合征（Hepatitises-Hydropericardium Syndrome，HPS）等疾病。禽腺病毒病在世界各地均有发生，一旦发病，会给养殖户带来巨大的损失。所以，高效、准确地诊断和预防禽腺病毒病极为重要，可有效防止疾病的传播。

1 禽腺病毒概述

1.1 禽腺病毒的分类

根据国际病毒分类委员会（The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）第10次报告，目前禽腺病毒属共有14个成员，分别为鸭腺病毒B，隼腺病毒A，鹅腺病毒A，鸽腺病毒A、B，鹦鹉腺病毒B，火鸡腺病毒B、C、D，禽腺病毒A、B、C、D、E。禽腺病毒共有14个血清型，如表1所示。禽腺病毒在鸡群中的感染现象普遍存在，在鹅、鸭、火鸡、鸽、鹦鹉、珍珠鸡及鸵鸟中也有腺病毒分离的报道。

1.2 传播

禽腺病毒的传播主要分为垂直传播和水平传播。通常，由染病鸡群的胚孵化而来的雏鸡中腺病毒检出率较高。一般鸡感染腺病毒后的排毒高峰在感染后的35～63 d，而产蛋高峰也会出现反复排毒的现象。腺病毒可以存在于感染鸡的咽喉、心脏、尿液、精液、粪便及肝脏。其中，染病鸡咽喉部的病毒通过呼吸释放到空气中，引起环境空气污染；或者粪便中的腺病毒可通过排泄物释放到环境中，造成饮水及饲料污染，均会引起腺病毒水平传播。因此，粪口途径是腺病毒传播的重要方式之一。另外，疫苗污染可能也是造成鸡群普遍感染腺病毒的原因之一。

1.3 病原性

大部分禽腺病毒可在健康禽类体内复制，自然感染时症状轻微或无感染症状，但鸡传染性贫血病毒、马立克病病毒、传染性法氏囊病病毒、新城疫病毒混合感染时，禽腺病毒的致病性增强，与腺联细小病毒混合感染时，禽腺病毒的致病性则有所下降。

1.4 致病性

1.4.1 包涵体肝炎（IBH）。腺病毒I群中FAdV-4通常可引起鸡只包涵体肝炎发生。发病鸡只羽毛凌乱，萎靡蜷缩，48 h内死亡或逐渐恢复。该病死亡率为10%～30%，多发于21～49日龄肉鸡。另外，鸽、鹦鹉、荼隼等也会感染腺病毒性包涵体肝炎。

1.4.2 心包积水综合征（HPS）。其也叫安卡拉病，FAdV-4常引起心包积水综合征。发病鸡只羽毛凌乱，萎靡蜷缩。临床剖检已发病鸡只，可见心包膜内出现无色或淡黄色水样或胶冻样积液。该病死亡率为20%～80%，肉鸡多发。

2 禽腺病毒诊断和防治研究进展

已知禽腺病毒I群血清型较多，近10年我国鸡群中禽腺病毒感染主要是血清型FAdV-4、FAdV-8a/b和FAdV-11型，其中FAdV-4型致病性最强［1］。FAdV-4的传统诊断方法是将病毒分离后进行血清学检测，检测周期长，不同血清型或同一血清型不同毒株检出率较低。近年来，发现应用分子生物学技术方法在病原体检测方面的准确率及效率较高，应用越来越多。对于禽Ⅰ群腺病毒的防控，目前我国主要采取疫苗免疫与卵黄抗体防治结合的方式。

2.1 诊断

2.1.1 临床症状。结合发病史初步诊断，再通过病理学观察进一步确诊。对发病鸡进行解剖，病变主要出现在肝脏、心脏和肾脏等部位。肝部组织颜色黄染、肿胀、质脆，可见点状出血点或胶冻样附着物等，或者出现心包积水情况；心脏部位多见淡黄色积液或出现局灶性坏死；肾脏肿大、有出血点或花斑肾，甚至会出现尿酸盐沉积现象。

2.1.2 病毒分离。可通过鸡胚进行分离培养，准确性较高，但检测周期长。鸡胚方式是经过尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚，每枚接种200 μL后，2～5 d可见鸡胚不同程度病变，进而将临床疑似鸡包涵体肝炎病例的肝组织再次接种到SPF鸡胚中，连续盲传3代，发现鸡胚在一定时间出现死亡或产生病变，与正常鸡胚相比，死亡胚体较正常鸡胚小，未死亡鸡胚较正常、但鸡胚通体肿大，取死亡鸡胚即分离得到腺病毒。细胞方式是采集病鸡肝脏，剪碎研磨过滤除菌后按照10%接入正常培养的LMH细胞中，细胞培养基换成维持液后培养病毒2～5 d，观察细胞病变出现情况，若出现细胞病变，盲传3代，均出现细胞病变则将细胞冻融3次，即获得病毒。

2.1.3 血清学诊断。该方法包括酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、血清中和试验和琼脂扩散试验（Agar Gel Precipitation，AGP）。刘延珂等［2］通过诱导表达FAdV-4中的Fiber蛋白，将其包被成抗原，建成了检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法，重复性及敏感性均较好。病毒中和试验特异性和敏感性较强，可用于病原鉴定、分型、检测抗体及分群等。智海东等［3］利用AGP方法检测腺病毒阳性血清样本，最早可以在8～12 h出现沉淀线，实用性较强。

2.1.4 分子生物学诊断。该方法包括普通聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）、环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）等。近年来，PCR诊断禽腺病毒的应用越来越多，该方法因特异性、敏感性和检测效率高等较受欢迎。PCR方法能在疾病早期通过咽拭子及泄殖腔拭子采样检测出感染病鸡，更早确诊。因禽腺病毒Hexon基因高度保守，可根据保守基因设计PCR引物。例如，向文彬等［4］根据GenBank中已发表的FAdV的全基因组序列，以病毒Hexon基因保守序列设计引物，PCR检测结果显示，该引物可用于FAdV-4、FAdV-8、FAdV-11的诊断。Real-time PCR与普通PCR的区别在于能定量检测病毒，敏感性和特异性更高。其常用的方法是SYBR Green I 染料和Taq Man探针2种。其中，SYBR Green I染料可以与所有DNA双链结合，优点是价格较探针方式便宜，且免去设计探针的工作，但由于存在染料与体系种的非特异性产物易结合的特点，易出现假阳性现象。Taq Man探针则特异性和敏感性更好，但需要设计探针，成本相对较高。夏梦圆等［5］根据禽腺病毒Hexon基因设计出特异性引物，建立了SYBR Green I实时荧光定检测I群4型禽腺病毒的方法，可重复性较好。罗洋洋等［6］根据禽腺病毒Hexon基因设计出特异性引物和探针，建立了TaqMan探针Real-time PCR方法，用于FAdV-4的诊断，其结果较普通PCR更灵敏，检出率提高10%。LAMP技术较普通PCR更为简便，无须模板热变性、长时间循环、电泳、紫外成像等过程，具有简单、快速、特异性强等特点。唐熠等［7］根据禽腺病毒Hexon基因设计一套特异性LAMP引物，建立LAMP快速检测I群4型禽腺病毒的方法。

2.2 疫苗

全病毒灭活疫苗是指用β-丙内酯或福尔马林灭活病毒辅以佐剂制成的疫苗。阮继湘等［8］研究发现新城疫、禽流感（H9亚型）、禽腺病毒病（Ⅰ群，4型）三联灭活疫苗分别免疫7、14、21日龄的SPF雏鸡和商品雏鸡，免疫后21 d用禽腺病毒（Ⅰ群，4型）强毒攻击，结果显示FAdV攻毒保护率均为100%。另外，FAdV-4油乳剂灭活疫苗可以有效预防IBH。免疫后攻毒解剖SPF鸡，心脏、肝脏等无病变情况，而人工攻毒的SPF鸡只存在心包积液及肝脏黄染等情况。

亚单位疫苗是指利用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性抗原的基因导入受体（菌或细胞），使其高效表达，而后提取保护性抗原，加入佐剂后而制成的疫苗。基因工程亚单位疫苗通常只含病原体的一种或几种只产生保护性免疫应答所必需的免疫原成分。WANG等［9］用大肠埃希菌表达了FAdV-4的六邻体蛋白、五邻体蛋白、Fiber-1和Fiber-2，通过动物试验比较各蛋白的免疫保护效果，结果显示Fiber-2的保护效果最好，从而说明表达蛋白的选择直接影响亚单位疫苗的效果。栾庆东等［1］成功表达了4种我国主要流行血清型FAdV的可溶性Fiber蛋白，采用LMH细胞接毒培养，而后开展交叉中和试验，结果表明FAdV-4、FAdV-8b和FAdV-11 Fiber蛋白抗血清对其他血清型病毒的感染无交叉中和作用，证明在细胞水平上这3种血清型FAdV全病毒间的交叉中和反应与Fiber蛋白无关。

截至2021年12月，我国全病毒灭活疫苗数量占比仍然较大。近年来，亚单位疫苗的研制数量逐渐增多。禽腺病毒新兽药注册三联苗2项，均为鸡新城疫、禽流感（H9亚型）、禽腺病毒（Ⅰ群，4型）三联灭活疫苗，其中腺病毒部分是不同毒株的全病毒灭活疫苗，已生产上市。目前，已通过临床试验审批的禽腺病毒的禽腺病毒灭活疫苗共31余项，主要是三联灭活疫苗、四联灭活疫苗。可以肯定的是，禽腺病毒多联灭活疫苗更受市场欢迎，可替代性低。

2.3 卵黄抗体

卵黄抗体是禽类在免疫适量抗原后产生的特异性抗体，对于病毒具有较好的治疗和预防效果。杨晓伟等［10］制备的抗禽腺病毒I群4型卵黄抗体，每只使用0.3 mL/只可保护15日龄肉鸡不发病，且每只使用剂量分别为0.8 mL、1.0 mL每只时，患病鸡治愈率分别为86.7%和96.7%，表明制备的卵黄抗体有较好的预防与治疗作用。杜东颖等［11］经诱导表达FAdV-4型Fiber-2蛋白，制成免疫原后免疫产蛋鸡，收获高免蛋，经提纯获得的精制卵黄抗体，用其注射SPF鸡进行免疫效果评价。结果表明，精制卵黄抗体经肌肉或皮下注射SPF鸡，注射后7 d内可保护鸡群抵抗禽腺病毒（C种，4型）强毒株的攻击，人工攻毒后24 h内在每只鸡肌肉或皮下注射抗体1.0 mL，可为感染鸡提供90%～100%的保护。

截至2021年12月，已通过临床试验审批的禽腺病毒卵黄抗体共4项。随着腺病毒发病率逐年递增，腺病毒防控产品市场空间较大，提示相关研究人员需要以市场需求为导向，聚焦禽腺病毒卵黄抗体的研究，提前规划布局，时刻为服务市场做准备。

3 研究展望

对于腺病毒的防控，要严格选用与流行株匹配的免疫原，而且需要迎合市场需求开发禽腺病毒多联灭活疫苗。目前，大多数Ⅰ群腺病毒不同血清型间的混合感染及禽腺病毒与其他病原体混合感染造成的腺病毒致病性增强方面的研究不够深入，需要系统研究腺病毒I群不同血清型疫苗的致病力及交叉保护效力。因安全性和稳定性好，卵黄抗体逐渐成为养殖户预防和治疗禽腺病毒的选择。即使卵黄抗体优点很多，但仍需优化实际生产中酸化、萃取、提取卵黄抗体的工艺，还需要开发出低成本且预防效果良好的卵黄抗体，来有效防控Ⅰ群禽腺病毒感染。目前，养殖过程中经常存在混合感染的情况，市场上单抗品种居多，而能同时抗多种病毒或者同种病毒不同型的产品相对较少，因此，研究抗多种疫病或多血清型病毒将成为一种趋势。禽腺病毒多联灭活疫苗一针防多病，再结合禽腺病毒卵黄抗体应用，将会获得更好的防疫效果。

参考文献：

［1］栾庆东，孙举，刘均华，等.我国主要流行的4种血清型禽腺病毒-Ⅰ群Fiber蛋白的交叉中和研究［J］.华北农学报，2020（5）：214-219.

［2］刘延珂，万文妍，王贝贝，等.禽腺病毒4型抗体间接ELISA检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2017（11）：902-906.

［3］智海东，解生亮，杨志，等.禽腺病毒Ⅰ型琼脂扩散抗原的研制及应用［J］.中国兽医科学，2009（8）：718-722.

［4］向文彬，陈俊宏，严红亚，等.云南省禽腺病毒检测与分子流行病学调查［J］.云南畜牧兽医，2020（6）：2-5.

［5］夏梦圆，罗意，徐春志，等.Ⅰ群4型禽腺病毒特异性SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用［J］.中国家禽，2018（6）：19-23.

［6］罗洋洋，李群辉，林丽苗，等.禽腺病毒血清4型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用［J］.中国兽医杂志，2020（4）：39-42.

［7］唐熠，谢芝勋，熊文婕，等.Ⅰ群禽腺病毒环介导等温扩增检测方法的建立［J］.中国兽医科学，2010（7）：713-716.

［8］阮继湘，章振华.新城疫-禽流感（H9亚型）-禽腺病毒病（Ⅰ群，4型）三联灭活疫苗对不同日龄雏鸡的免疫效力研究［J］.中国家禽，2021（10）：111-115.

［9］WANG X，TANG Q，CHU Z，et al. Immune protection efficacy of FAdV-4 surface proteins fiber-1，fiber-2，hexon and penton base［J］.Virus Research，2017（245）：1-6.

［10］杨晓伟，杨万秋，陆婧，等.禽腺病毒Ⅰ群血清4型的分子鉴定及其卵黄抗体的防控效果［J］.畜牧与兽医，2018（1）：113-117.

［11］杜东颖，黄晓静，刘武杰，等.禽腺病毒（C种，4型）精制卵黄抗体研制及免疫效果评价［J］.中国兽医学报，2021（5）：895-899.